免疫荧光法检测原核和真核细胞中表达的轮状病毒外壳蛋白VP4

目的：用免疫荧光法快速检测原核和真核细胞中表达的轮状病毒（RV）外壳蛋白VP4。方法：以抗VP4的抗体为一抗、FITC标记的羊抗豚鼠IgG为二抗,用免疫荧光方法检测在大肠杆菌BL21（DE3）中重组表达的同源RVVP4;检测SA11或Wa株RV感染MA104细胞后不同时间段病毒VP4的合成及其在感染细胞中的分布情况。结果：用免疫荧光法可直接检测到原核细胞中表达的外源蛋白,也可检测到病毒蛋白在真核细胞中的分布情况。结论：免疫荧光法可特异、方便、快速地检测RV VP4在原核和真核细胞中的表达;来源于RV TB—Chen株的VP4抗体可特异性识别同源病毒VP4,交叉识别SA11或Wa株的VP4。     

G1型A组轮状病毒地方株VP7基因在杆状病毒系统中的表达

Ａ组轮状病毒是导致婴幼儿重症腹泻的最主要病毒病原,每年因轮状病毒腹泻造成的死亡超过１００万人。ＶＰ７是病毒外壳上的主要糖蛋白,具有中和抗原活性,与病毒的毒力及免疫保护性有关。也是划分血清型的主要标志,而对疫苗的研究证明,不同血清型之间的交叉保护作用甚...     

A组轮状病毒G4型地方株VP7基因在杆状病毒系统中的表达

Ａ组轮状病毒是导致婴幼儿重症腹泻的最主要病毒病原,位于病毒外壳上的ＶＰ４和ＶＰ７蛋白具有中和抗原活性,与病毒的毒力及免疫保护性有关。ＶＰ７是外壳上的主要糖蛋白,根据其抗原性的不同,可将Ａ组轮状病毒划分出不同的血清型（Ｇ１～Ｇ１４）［１］,而对疫苗的研...     

人A组轮状病毒北京地方株VP4血清型特异片段编码基因的序列分析

轮状病毒是引起婴幼儿严重腹泻的重要病原,其第四基因编码主要中和抗原VP4,而VP4可裂解为VP8和VP5两个片段。VP8为抗原型特异性片段。克隆并测定了具有代表性的三个轮状病毒北京株VP4编码基因5′端（VPS＋VPS一部分）887个核苷酸序列并据此推导出其氨基酸序列。结果表明,相同血清型的地方株和标准株之间具有高度同源性（92％～966％）,不同血清型间则变异较大（70．5％～71％）。氨基酸最大变异处位于aa84～172,并对胰酶作用位点在致病性中的可能性进行了讨论。     

在昆虫细胞中表达G2型轮状病毒地方株VP7基因

Ａ组轮状病毒是导致婴幼儿重症腹泻的最主要病毒病原,ＶＰ７是病毒外壳上的主要糖蛋白,它具有中和抗原活性,与病毒的毒力及免疫保护性有关,也是划分病毒血清型的最主要标志之一〔１〕。ＶＰ７基因及其编码蛋白一直是人们研究的主要对象,很多研究工作和诊断试剂都需大...     

2018–2020年人轮状病毒锦州地方株VP4及VP7基因特征

【背景】人A组轮状病毒(Rotavirus Group A,RVA)是婴幼儿胃肠炎的主要病原体及发展中国家婴幼儿死亡的重要原因,目前无特效药物治疗,疫苗预防是唯一可行的预防感染方法。外衣壳蛋白VP7和VP4是疫苗设计的主要靶点,针对该基因加强RVA地方株分子流行病学监测十分必要。【目的】对锦州地方流行RVA株VP7和VP4基因进行型别鉴定和序列特征分析。【方法】收集锦州地区2018-2020年RVA感染腹泻患儿的粪便标本,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增VP7、VP4基因片段并测序,得到7株RVA VP7和VP4序列。使用在线基因分型工具Rota C V2.0对测序结果进行分型分析。应用BLAST、DNAStar、MEGA X、Bio Edit等生物软件与临床流行株及疫苗株进行系统发育分析及氨基酸序列比对分析。【结果】分型结果表明7株锦州地方株均为G9P[8]型,系统发育分析证实其VP7和VP4基因分别属于G9-Ⅵ和P[8]-3谱系,核苷酸序列相似性分别为99.32%-100%与99.41%-100%。JZ株VP7与疫苗株Rotavac和Rotasiil相比,在抗原表位区7-1a、7-1b、7-2中分别存在4个和3个氨基酸替换。JZ株VP4与疫苗株Rotarix和Rota Teq VP4氨基酸序列相比,发现7个和4个氨基酸替换,位于抗原表位区8-1和8-3。【结论】2018-2020年在辽宁锦州地区检测到7株G9P[8]型RVA株,VP7和VP4序列相似性高于99%,G9P[8]型可能是辽宁省锦州地区2018-2020年婴幼儿轮状病毒腹泻的主要流行基因型之一。与同基因型疫苗株比较,位于JZ株VP7和VP4抗原表位区的氨基酸位点差异对于野毒株免疫逃逸机制的研究具有意义。     

A组人轮状病毒VP6基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达

轮状病毒(rotavirus RV) 结构蛋白VP6位于病毒三层衣壳结构的中间层,在病毒粒子的形成过程中起重要的作用。从临床样品中分离的人轮状病毒TB-Chen株VP6基因通过RT-PCR得到扩增产物。以pET作为表达载体,将VP6蛋白编码基因序列插入到质粒pET中成功构建原核表达质粒pET-VP6。实验表明,带有pET-VP6质粒的大肠杆菌BL21(DE3)可以高效表达目的蛋白VP6,重组表达产物VP6占菌体总蛋白的27.4%, 其分子量约为45 kDa,并且能被豚鼠抗SA11血清抗体识别（Western blot）。这一结果为进一步研究VP6的结构和功能奠定了重要的物质基础。     

A组轮状病毒我国地方株VP6基因的序列测定及其在杆状病毒系统中的表达

通过反转录－ 聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ） 获得了轮状病毒地方株 Ｔ１１４ Ｖ Ｐ６ 全基因的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段,将其克隆入转移载体质粒ｐ Ｖ Ｌ１３９３ 中,构建成重组质粒ｐ Ｖ Ｌ１３９３ － Ｖ Ｐ６ 。对克隆的 Ｖ Ｐ６ 基因进行序列测定,并用它和杆状病毒（ Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ） 野毒株 Ｄ Ｎ Ａ 共转染 Ｓｆ９ 细胞,筛选纯化得到含 Ｖ Ｐ６ 基因插入片段的重组杆状病毒,并进行了表达重组蛋白 Ｖ Ｐ６ 的检测。测序结果显示 Ｖ Ｐ６ 基因全长１ ３５６ｂｐ ,序列分析显示与 Ｗａ 株非常接近,提示 Ｔ１１４ 为亚组Ⅱ病毒株。用高价免疫血清经 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测表达产物,结果显示,重组病毒感染细胞裂解液样品中可见大小约４５ｋ Ｄ 的特异条带;亚组Ⅱ特异性单抗检测到大小约１２０ｋ Ｄ 的条带,提示重组蛋白 Ｖ Ｐ６ 获得了表达,具有正常的抗原反应性和天然 Ｖ Ｐ６ 的三体结构。     

轮状病毒外壳蛋白VP7在转基因番茄果实中的特异表达

将轮状病毒外壳蛋白VP7基因克隆到含有番茄果实特异性启动子TFP的植物表达载体pTF ,并转化到根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA10 5中 ,采用叶盘转化法转化番茄 (LycopersiconesculentumMill.)栽培品种TX0 0 14 ,获得了转基因植株。经PCR、PCR Southernblot和Southernblot分析表明VP7基因已整合到转基因番茄植株的核基因组中 ,RT PCR、Westernblot结果表明VP7蛋白在果实中获得了特异表达     

高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备

高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)是世界上分布最广的侵染甘蔗的病毒之一,引起甘蔗花叶病,对甘蔗产业危害很大。根据SrMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列合成一对引物,以海南(SrMV-HN)染病植株总RNA为材料,采用RT-PCR方法克隆了长约987 bp的目的片段。将CP基因与质粒pET32a(+)连接,构建了含SrMV CP基因的融合蛋白原核表达载体pET32a-SrMVCP。然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测出一条约36kD的特异融合蛋白表达谱带。融合蛋白主要以可溶性蛋白形式稳定表达。通过优化诱导条件,确立了CP基因表达的最佳条件:IPTG终浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为30℃。用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清。通过酶联法(ID-ELISA)测定本试验制备的SrMV CP抗血清工作浓度为1∶1 000,Western blotting检测结果表明,抗血清与SrMV-HN诱导表达的CP蛋白发生特异性反应。对田间25个甘蔗样品进行检测,结果表明该抗血清的效价高、灵敏度高、特异性强,可以应用于田间样品的检测。     

A组轮状平素我国地方株VP6基因的序列测定及其在杆状病毒系统中的表达

通过反转录－聚合酶链反应获得了轮状病毒地方株Ｔ１１４ ＶＰ６全基因的ｃＤＮＡ片段,将其克隆入转移载体质粒ｐＶ Ｌ１３９３中,构建成重组质粒ｐＶＬ１３９３－ＶＰ６。对克隆的ＶＰ６基因进行序列测定,并且它和杆状病毒野毒株和ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,筛选纯化得到含ＶＰ６基因插入片段的重组杆状病毒,并进行了表达重组蛋白ＶＰ６的检测。     

鹅细小病毒长春分离株主要结构蛋白(VP2-VP3)基因的原核表达

根据国外巳发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列,设计并合成了一对用于GPV主要结构蛋白（VP2-VP3）基因表达的引物。利用合成的引物,扩增并鉴定了GPV中国长春株（GPV CC株）的VP2-VP3基因。将扩增的目的的基因插入到原核表达载体pET28(a)的多克隆位点,构建了表达GPV,VP2-VP3基因的原核载体pEGVP1。重组表达载体质粒转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到大小分别为75000和58000的表达蛋白带。Western blot分析表明,表达产物具有很好的特异性。     

甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因原核表达研究

本研究主要目的是构建ScYLV-CP基因的原核表达载体,表达ScYLV-CP蛋白。采用PCR扩增出CP基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体中,再经双酶切、亚克隆到表达载体中,构建该基因的表达载体pET-29 a-CP,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳。酶切鉴定表明表达载体内插入片段正确,在大肠杆菌中诱导后,出现一条分子量约为22 kDa蛋白带,与CP基因开放阅读框架的理论推算值21.719 kDa相符。研究表明甘蔗黄叶病毒外壳蛋白能在原核细胞中高效表达,为建立甘蔗黄叶病毒血清学快速检测技术奠定基础。     

甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白基因原核表达载体的构建与表达

目的:用原核表达的方法获取大量带6个His标记的甘蔗花叶病毒E株系(ScMV-E)外壳蛋白(CP)。方法:用带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的特异引物,以带有多个基因的重组质粒pNUSCP为模板,扩增出片段长度为942bp的ScMV-E外壳蛋白基因,亚克隆到pMD18-T载体上,转化E.coliDH5α,经双酶切检测获得阳性克隆。BamHⅠ和SalⅠ双酶切阳性克隆质粒,回收目的片段ScMV-E的CP基因。把目的片段插入表达载体pET29a( ),转化E.coliBL21(DE3),测序。结果:阳性质粒pET29a-CP在E.coliBL21(DE3)中得到大量特异表达。SDS-PAGE分析表明,该蛋白的相对分子质量约36000,与预测一致。结论:以上方法可以得到带6个His标记的目的蛋白,有利于纯化并获取高纯度的ScMV-E的外壳蛋白。     

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

依据马铃薯S病毒 (PotatovirusS ,PVS)外壳蛋白 (CP)基因序列 (885bp)设计合成了两对引物 ,通过RT PCR扩增得到长 0 .8kb的目的片段 ,将目的片段转入大肠杆菌 ,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子 ,测定序列结果与其他PVS分离物CP基因的序列比较 ,发现其核苷酸同源性达 95 %左右 ;构建了含PVSCP基因的融合蛋白原核表达载体 ,并在大肠杆菌中得到表达 ,SDS PAGE测定融合蛋白的分子量为 5 8kD。     

猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5’端(1bp-750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E．coli．BL2l(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Westernblot分析、纯化和血清中和抗体试验。结果表明：JL94株与国外分离株CRW．8株、BEN．307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96．98％和98．05％,说明JL94株与CRW．8株、BEN．307株属于同-vP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26％;Westernblot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MAl04细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性。     

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

依据马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)外壳蛋白(CP)基因序列(885bp)设计合成了两对 引物,通过RT-PCR扩增得到长0.8kb的目的片段,将目的片段转入大肠杆菌,酶切鉴定证明 得到了含有目的片段的重组子,测定序列结果与其他PVS分离物CP基因的序列比较,发现其核苷酸同源性达95%左右;构建了含PVS CP基因的融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE测定融合蛋白的分子量为58kD.     

利用番茄为受体表达轮状病毒外壳蛋白VP7的研究

将轮状病毒外壳蛋白VP7基因克隆到植物表达载体pBll21,并转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHAl05中,采用叶盘转化法转化番茄(1ycopersicon esculentumMill．)栽培品种TX0014,获得了转基因植株．经PCR、PCR—Southernblot和Southernblot分析表明：VP7基因已整合到转基因番茄植株的核基因组中．RT—PCR、Westernblot分析表明：VP7蛋白在叶片和果实中均获得了表达．     

G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6和NSP4编码基因的分子特征

最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚群为SGⅡ型,NSP4的基因型为B型。系统进化树分析表明,卢龙株LL36755的VP7、VP4编码基因与猪来源的毒株关系密切,而VP6、NSP4编码基因与人来源的毒株紧密相联系。可以推断新的人腹泻A组轮状病毒LL36755株是猪的VP7,VP4编码基因与人的VP6,NSP4编码基因的自然重组;而且该毒株不是G5的原型,很可能是人类轮状病毒与猪轮状病毒毒株的自然重组后逐步进化而来。     

SA11株轮状病毒VP7基因的克隆及表达

采用RT PCR方法 ,从提取的SA1 1株轮状病毒总RNA中扩增出VP7基因片段 ,进行鉴定后 ,将该片段克隆于真核表达载体pEF1 HisC dhfr,构建成重组质粒pEF1 HisC dhfr VP7,然后用质脂体法转染COS 7细胞 ,进行真核系统的表达 .获得了长 981bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知VP7序列相同 .表达后经细胞超声破碎 ,Westernblot检测表达产物 ,在相对分子质量 38× 1 0 3 处有表达条带 ,表达蛋白主要存在于上清中 .因此 ,获得了VP7基因 ,并在COS 7细胞中获得了表达 ,表达蛋白质免疫Balb c小鼠 ,获得了具有特异性结合活性的抗体