嗜热毛壳菌一种β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性

研究了嗜热毛壳菌Chaetomiumthermophilum液体发酵产生的一种胞外β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析、SephacrylS-100分子筛层析等步骤后获得凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。经10%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法分别测得该酶的分子量大小约为118.0kDa和120.1kDa。该酶反应的最适温度为70℃,最适pH值为4.0~5.0。有高的热稳定性,在60℃保温1小时酶活性不丧失,在70℃时的半衰期为16min,在90℃保温10min仍具有7.6%的活性。且能在pH4.0~11.0之间保持稳定。金属离子对β-葡萄糖苷酶的活性影响较大,其中Ca2 、Ba2 对酶有激活作用,而Zn2 、Cu2 、Al3 、Ag 、Hg2 对酶有显著的抑制作用。     

嗜热毛壳菌内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

探讨了液体发酵嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophile)产生的内切β－葡聚糖酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵分级沉淀,DEAE－Seplharose Fast Flow阴离子层析,Pheny1-Sepha-rose疏水层析,Sephacry1 S-100分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的内切β－葡聚糖酶,经12．5％SDS－PAGE和凝胶过滤层析法分离纯化酶蛋白的分子量约为67．8kD的69．8kD。该酶反应的最适温度和pH分别为60℃和4．0－4．5在pH5.0条件下,该酶在60℃下稳定：70℃保温1h后,仍保留30％的活性;在80摄氏度的半衰期为25min,金属离子内切β－葡聚糖酶的活性影响较大,其中Na^ 对酶有激活作用;Fe^2 ,Ag^ ,Cu^2 ,Ba^2 ,Zn^2 等对酶有抑制作用。该酶对结晶纤维素有没水解能力。     

嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因(Im)的克隆及其在毕赤酵母中的表达

研究从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum中克隆了一个新的脂肪酶基因(lm).其中DNA序列包含一个由870个碱基构成的开放阅读框,编码289个氨基酸,含有4个内含子,没有信号肽序列.序列提交GenBank,登录号为GU338248.将该基因在毕赤酵母中表达.在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,蛋白达到0.428mg/mL,酶活力为19.77U/mg.SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为35kDa.该脂肪酶的最适反应温度为60℃,具有热稳定性,在40-80℃热稳定,80℃处理60min仍有65％的相对酶活.该酶最适反应pH值为10.0,在pH 9.0--12.0酶活相对稳定.该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,具有良好的工业应用价值.     

嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因(lm)的克隆及其在毕赤酵母中的表达(英文)

研究从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum中克隆了一个新的脂肪酶基因(lm)。其中DNA序列包含一个由870个碱基构成的开放阅读框,编码289个氨基酸,含有4个内含子,没有信号肽序列。序列提交Gen Bank,登录号为GU338248。将该基因在毕赤酵母中表达。在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,蛋白达到0.428mg/m L,菌物学报酶活力为19.77U/mg。SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为35k Da。该脂肪酶的最适反应温度为60℃,具有热稳定性,在40–80℃热稳定,80℃处理60min仍有65%的相对酶活。该酶最适反应p H值为10.0,在p H 9.0–12.0酶活相对稳定。该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,具有良好的工业应用价值。     

嗜热毛壳菌内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

探讨了液体发酵嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)产生的内切β葡聚糖酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE\|Sepharose Fast Flow阴离子层析、Pheny1\|Sepharose疏水层析、Sephacry1 S\|100分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的内切β\|葡聚糖酶。经125%SDS\|PAGE和凝胶过滤层析法分别测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为67.8kD和69.8kD。该酶反应的最适温度和pH分别为60℃和40～45在pH50条件下,该酶在60℃下稳定;70℃保温1h后,仍保留30%的活性;在80℃的半衰期为25min。金属离子对内切β\|葡聚糖酶的活性影响较大,其中Na+对酶有激活作用;Fe2+、Ag+、Cu2+、Ba2+、Zn2+等对酶有抑制作用。该酶对结晶纤维素没有水解能力。     

嗜热栖热菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质研究

用PCR方法从嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27中扩增出编码α-葡萄糖苷酶基因hbg,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a( )上,电击转化E.coliBL21(DE3),获得高效表达hbg基因的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为59kD,与预期分子量相符。经镍柱和阴离子交换柱纯化的重组表达的α-葡萄糖苷酶HBG最适温度为95℃,最适pH值为5.0。     

疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶的纯化及其性质研究

采用硫酸铵沉淀、DEAE SepharoseFastFlow阴离子层析、Phenyl Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的疏绵状嗜热丝孢菌 (Thermomyceslanuginosus)几丁质酶。经SDS PAGE和凝胶过滤层析测得纯酶蛋白的分子量在 4 8～ 4 9 .8kD之间。该酶反应的最适温度和最适pH分别为 5 5℃和 4 5 ,在pH4 5条件下 ,该酶在 5 0℃以下稳定 ;6 5℃的半衰期为 2 5min ;70℃保温 2 0min后 ,仍保留 2 4 %的酶活性。其N 端氨基酸序列为AQGYLSVQYFVNWAI。金属离子对几丁质酶的活性影响较大 ,Ca2 、Na 、K 、Ba2 对酶有激活作用 ;Ag 、Fe2 、Cu2 、Hg2 对酶有显著的抑制作用 ;以胶体几丁质为底物的Km 和Vmax值分别为 9 .5 6mg mL和 2 2 . 12 μmol min。抗菌活性显示 ,该酶对供试病原菌有不同程度的抑制作用。     

嗜热链霉菌过氧化氢酶的纯化及性质研究

嗜热链霉菌(Thermostreptostreptomyces sp.)T485的除去菌体的培养液,经硫酸铵盐析,Sepha- dex G—100、DEAE—Sephadex A-50及羟基磷灰石等柱层析,得到了凝胶电泳均-的过氧化氧酶,纯化了954倍,得率为7％。用浓度梯度PAGE测定分子量为152000,SDS—PAGE测定亚基分子量为57000,凝胶薄层等电点聚焦测定等电点为4．25。过氧化氢酶的反应最适温度为60℃,最适pH为7．0;对H2O2的K为50 mmol·L-1,Vmas值为6．0 mmol·min-1·mg-1。Nall3和Hg2+对酶活力有强烈抑制作用．Ca2+对酶活力有激活作用。测定了波长200—500nm的吸收光谱,在405nm处有明显的吸收峰。根据受NaN3,抑制和吸收光谱性质,推测它为含血红素酶。此外还测定了过氧化氢酶的氨基酸组成。     

嗜热栖热菌HB 8耐热α-葡萄糖苷酶的提纯和性质

嗜热栖热菌HB 8(Thermus thermophilus<.I> H8 8 )的耐热α-葡萄糖苷酶(α-glucosidaseEC．.2.1.20)经硫酸铵分步沉淀、DEAE-纤维素柱层析和垂直板制备凝胶电泳提纯,经盘状凝胶电泳鉴定为单一区带,比活提高17倍。酶作用最适温度80℃,最适pH5．8,分子量67000,等电点Pl为4.5。该酶能够水解对硝基酚α--D-葡萄糖苷(PNPG)、蔗糖和麦芽糖,但不水解纤维二糖、蜜二糖、可溶性淀粉。酶作用于PNPG的米氏常数(Km)为0.4mmol／L,最大反应速度Vmax为0.29umol·nmin-1·mg-1。金属离子Mg2+、Mn2+、Ca2+和Ba2+对酶有激活怍用,Hg2+和Cu2+有强烈抑制作用。酶表现出极好的热稳定性,在90℃保温10小时后,仍保留90％的原始酶活力,在95℃的失活半寿期(t1/2)为108分钟．经蛋白质侧链化学修饰研究表明,羧基和组氨酸残基为其表现话力所必需。     

绵毛嗜热丝孢菌木聚糖酶的纯化与性质

研究了绵毛嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus W205胞外木聚糖酶的纯化与性质。粗酶液经硫酸铵沉淀和Q-Sepharose FF离子交换层析即可得到电泳纯木聚糖酶,回收率为46.6%,比酶活为1396.9U/mg。该酶的最适pH和最适温度分别为pH7.0和75℃,pH稳定范围为5.5-10.8,70℃处理30min残存酶活在70%以上。薄层层析结果显示该酶水解桦木木聚糖的主要产物是木二糖和木三糖,并且能够通过转糖苷作用将木三糖转化为木二糖。该木聚糖酶易于纯化并且具有较宽的pH稳定性及良好的热稳定性,具有较大的潜在工业应用价值。     

同源过表达BglR对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性的影响

目的:克隆嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila ATCC42464)bglr基因,构建Mtbglr过表达载体,研究同源过表达bglr对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性及总纤维素酶活性的影响。方法:利用SLIC技术构建Mtbglr过表达载体;使用MtPpdc启动子及MtTpdc终止子将该基因进行同源过表达;利用原生质体转化、实时荧光定量PCR和酶活测定等技术实现bglr基因在嗜热毁丝霉中表达及酶活水平的鉴定。结果:成功构建Mtbglr过表达载体,并转化嗜热毁丝霉,结果表明,诱导培养条件下,转化子Mt8菌株的β-葡萄糖苷酶活性和胞外蛋白质浓度分别是WT菌株的1.7倍和1.9倍。结论:bglr基因对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性具有增强作用,为嗜热真菌β-葡萄糖苷酶基因调控奠定了理论基础。     

嗜热淀粉芽孢杆菌来源β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21,β-glucosidase),是纤维素分解酶系中的重要组成部分,目前工业上应用的β-葡萄糖苷酶多数来源于植物和真菌,来源于细菌的较少,且应用中还存在酶活力偏低、热稳定性差、反应条件适用范围窄、酶活力易受产物反馈抑制等问题,增加了经济成本。嗜热微生物具有特殊的遗传信息资源,极有可能从中挖掘到酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,从而解决工业难题。【目的】从嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因,通过基因重组、异源表达和蛋白纯化技术制备新型β-葡萄糖苷酶,并探究其酶学性质,为新型β-葡萄糖苷酶在纤维素水解等领域的应用奠定基础。【方法】人工合成新型β-葡萄糖苷酶基因bgl52,构建重组表达质粒pET22b-bgl52,并用电脉冲法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化得到高纯度的β-葡萄糖苷酶Bgl52。【结果】实现重组表达质粒pET22b-bgl52在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达,并获得β-葡萄糖苷酶Bgl52纯蛋白,蛋白分子量...     

嗜热微生物酶的嗜热机制及应用研究进展

从细胞膜组分、蛋白质结构、遗传物质、钨元素等方面阐述了嗜热微生物酶的嗜热机制 ,并简要介绍了其应用的研究进展。     

双胸蚓纤溶酶的纯化及性质

 用硫酸铵分段盐析、超滤膜分级分离及DEAE-纤维素、Sephadex A-25和Sephadex G-50三种柱层析方法从双胸蚓组织的粗提取液中分离纯化出一种纤溶酶,分子量为29kD,由一条肽链组成。此晦具有强烈的溶解纤维蛋白的作用,对家兎实验性血凝块也具有明显的溶解作用。此酶的最适pH为8.0,在pH7.6～8.4之间活力相差不到2％;酶在PH4.7—11.0范围内稳定;酶作用的最适温度为57℃;此酶热稳定性较好,于25～50℃保温3小时,酶活力基本不变,60℃时,活力保留65％。金属离子Na~(+)、K~(+)、Mg~(2+)等可提高此酶的活力,而Hg~(2+)、Ca~(2+)等金属离子对此酶有不同程度的抑制作用。     

嗜热酶的特性及其应用

海洋微生物作为一类生长在特殊极端环境下的生物正日益引起人们的重视。其中嗜热微生物由于能在高温温泉及火山口附近的高热环境下生长而引起人们的极大关注[1] 。同时 ,人们也从许多人工高热环境 (如堆肥 )中分离得到这种嗜热菌。近年来 ,人们从这些嗜热菌中已分离得到多种嗜热酶 (5 5℃～80℃ )及超级嗜热酶 (80℃～ 1 1 3℃ ) [2 ] 。嗜热酶不仅具有化学催化剂无法比拟的优点 ,如催化效率高和底物专一性强 ,而且酶在高温条件下的稳定性极好[3 ] 。因而它可以克服中温酶 (2 0℃～ 5 5℃ )及低温酶 (-2℃～ 2 0℃ )在应用过程中常常出现的…     

嗜热古菌Thermofilum adornatum来源的高温热激活β-葡萄糖苷酶TaBgl3的原核表达及酶学性质研究

【目的】β-葡萄糖苷酶，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，属于纤维素酶类，是一种降解纤维素的关键限速酶。来源于嗜热古菌的β-葡萄糖苷酶已被广泛验证具有酸性高温等特性，已成为高温酶的研究热点之一。本文对尚未报道的来源于嗜热古菌中一种热丝菌（Thermofilum adornatum）的GH3家族的葡萄糖苷酶，进行了原核表达和酶学性质测定，以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。【方法】从NCBI数据库中获得了嗜热古菌（T.adornatum）来源的GH3氨基酸序列，构建重组质粒p ET-30a（+）-TaBgl3，并在大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）感受态细胞中诱导表达重组蛋白；采用磁珠纯化，研究其酶学性质。【结果】重组蛋白TaBgl3的分子量为77.0 kDa；酶学性质结果表明，其最适反应条件为80°C和pH 5.0，在70°C保温处理1–4 h，对TaBgl3的酶活力有促进作用，在最适温度80°C处理2 h后，其激活作用更加明显，能提高40%以上的酶活；其在pH 5.0–8.0下37°C保温1 h，仍具有60%以上的活性；底物为对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p NP...     

嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus热稳定几丁质酶的克隆表达及活性研究

研究通过RT-PCR和Tail-PCR技术从嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus中克隆了一个几丁质酶同源基因。该基因全长1,253bp,包含一个由1,197个碱基构成的开放阅读框,编码398个氨基酸。序列比对分析表明,该基因编码蛋白属于糖苷水解酶18家族的几丁质酶。利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体,并转化毕赤酵母。在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,达到0.433g/L,酶活力为28.96U/mg,同时对表达的几丁质酶进行了纯化,SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为43.9kDa。该几丁质酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH值为8.0,70℃处理30min仍有45%的相对酶活,具有较好的热稳定性及工业应用价值。     

一株极端嗜热木聚糖分解细菌的分离及特性

从四川康定热温泉中分离出一株厌氧、极端嗜热的木聚糖分解细菌、该菌株革兰氏染色阴性 ,不运动 ,不形成芽孢 ,细胞呈杆状 ,单个或成对排列 ,宽 0. 7～ 1.0μm ,长 2 .0～ 5 .0μm .在木聚糖琼脂滚管上 75℃培养 3 d以后的菌落呈圆形、凸状、边缘整齐、透明、不产色素、发酵木聚糖产生二氧化碳、氢、乳酸、乙酸及微量乙醇 .