测定脱氧核糖核酸酶的简单方法——荧光法

脱氧核糖核酸酶 (DNase) 是真核与原核细胞中广泛存在的DNA水解酶。1962年Kurnick曾对某些根据底物特性变化来测定DNase活性的方法作了评述。近年来建立了更灵敏的用同位素测定DNase活性的方法。但由于同位素价格高昂,危险,又受本身半衰期和比强度的限制,有时又需自己标记合成底物,所以在应用上有一定的局限性。本文介绍一种简单、灵敏的测定DNase活性的荧光法。其基本原理是根据DNA和溴化乙锭(EB)结合发生荧光,其强度与DNA量成正比。当EB-DNA复合物经DNase处理后,由于DNA被降解、     

提取航天诱变向日葵种子总RNA的一种有效方法

目的:从航天诱变向日葵种子中提取高质量的总RNA.方法:采用改进的SDS法,提取缓冲液与氯仿同时作用液氮研磨材料后,用酸酚-氯仿抽提一次,经LiCl过夜沉淀、DNase I处理、1/2体积的无水乙醇沉淀多糖,最后加入1/10体积的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇沉淀总RNA,用琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光度法测定产量与纯度,用...     

玉米基因组DNA提取及浓度测定方法评价

以非转基因玉米种子为材料,比较了常用的3种植物基因组DNA提取试剂盒及改良的CTAB法,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度及实时荧光PCR扩增检测,对提取得到的基因组DNA的纯度、得率及4种提取方法的重复性、提取时间进行分析;比较紫外分光光度法、Qubit荧光法、Pico Green荧光分光光度法,以实时荧光定量PCR检测结果为参照,对3种DNA浓度测定方法的准确性进行分析.结果显示,磁珠法(Promega)最适合应用于快速、简便、高效检测中的植物基因组DNA提取,能有效获得纯度高、完整性好的基因组DNA,并且磁珠法提取效率高,重复性好,提取时间短;在基因组DNA浓度测定中,紫外分光光度法、Qubit荧光法、Pico Green荧光分光光度法的相对误差分别为99.8％、49.8％和28.9％,表明Pico Green荧光分光光度法测定DNA浓度的准确度最高.     

应用荧光、水试和紫外吸收法鉴别伪劣中药材

为了建立快速鉴别多种中药材真伪优劣的方法,利用荧光鉴别、水试和紫外吸收法对多种中药材进行鉴别、检查。实验结果表明,法半夏、金银花、木香、柴胡、巴戟天等可通过紫外激发荧光、水试或紫外吸收图谱来快速鉴别药材真伪。本研究结果表明,以上三种方法快速、简便,可应用于有荧光反应、水试反应和紫外吸收特性的中药材的快检筛查。     

空肠弯曲菌LAMP快速检测方法的建立

本研究使用恒温环介导技术, 以空肠弯曲菌的促旋酶基因A(gyrA)设计引物, 建立空肠弯曲菌的LAMP快速检测方法。不同来源的4株空肠弯曲菌LAMP检测均显示阳性, 其他14种细菌LAMP检测显示阴性。实验结果表明, 设计的引物具有良好的特异性。本研究进行了LAMP检测方法与细菌平板计数法和PCR法的灵敏度比较, 结果LAMP检测与PCR法有相近的灵敏度, 比细菌平板计数法灵敏度高3个数量级。我们还研究发现提取核酸前加入DNase可以有效地减少死菌DNA对LAMP结果的影响。使用LAMP方法对鸡法氏囊的检测表明, 结合核酸提取步骤中的DNase处理步骤, 可以准确的检测出鸡法氏囊中的空肠弯曲菌。     

DNase的DNA-PAGE快速分析法

核酸酶,特别是DNase,往往和机体的生理状况及病变有密切的关系,如果能建立一种简便的核酸酶分析方法,将对临床诊断、探讨病变机制及筛选药物都有一定的价值。关于DNase的分析Boyd等先后建立了DNA-聚丙烯酰胺凝胶电泳(DNA-PAGE)法;Brown等又将它加以简化,并将它直接用于细胞抽提液中DNase的鉴定与比较。本文又作了改进,降低了分离胶中的DNA含量,并以溴化乙锭(Ethidium Bromid),代替焦宁Y(Pyronin Y)。结果表明,改进后保温与染色时间可以大大缩短,检测灵敏度提高。应用这种方法检定人和小鼠白细胞和肝细胞中的DNase,表明,不同类型的细胞中包含各自特征的DNase酶谱,而且它对反应条件有不同的要求,对抑制剂有不     

一种适于微生物多样性分析的青贮饲料总DNA的提取方法

目的:提出一种适于微生物多样性分析的青贮饲料中微生物总DNA的提取方法,并评价其效果.方法:间接法抽提样本的总DNA,通过琼脂糖电泳、紫外吸收及PCR分析DNA质量,DGGE评价提取效果,用PCR扩增目的菌株的特定片段来检测提取方法的灵敏度.结果:两个样本DNA的A260/A280值分别为1.99和1.93,A260/,A230值分别为2.19和1.90,提取的DNA不需纯化便可直接用于16S rRNA基因的扩增,提取方法灵敏度为3cfu/g,DGGE结果表明提取方法可以涵盖样品中的所有微生物.结论:提取的DNA纯度较高,可直接用于下游分子操作,提取方法灵敏度较高,能全面反映样品中的微生物原貌,可用于免培养法研究青贮饲料中的微生物菌群组成.     

骨组织总RNA的提取技术

目的探讨Trizol试剂提取骨组织总RNA的技术方法。方法采用高速均质仪进行组织粉碎处理,用Tr-izol试剂提取RNA后,分3组进行RNA纯化处理,并通过紫外分光光度计、电泳、Real-time PCR等方法验证RNA的质量。结果用Tirzol试剂从经粉碎处理的骨组织中所提取的总RNA纯度差,只有再进行DNase1消化及有机溶剂再纯化后,才能保证所提RNA完整且纯净。结论从组织中提取的总RNA经DNase1消化及有机溶剂抽提,可提高RNA质量;另外实验证实用紫外分光光度法判断RNA的质量有许多局限性,利用琼脂糖电泳及Real-time PCR方法也能很简便的判断RNA质量。     

荧光标记法测定核糖核酸片段的核苷酸序列

核糖核酸一级结构的研究,近十几年有了很大进展。继1965年Holley用紫外吸收法,首次测定了酵母丙氨酸tRNA的一级结构之后,Sanger等人用灵敏度更高的放射性同位素体内标记的方法,测定了其它小分子量核糖核酸的一级结构。近几年,Randerath等用高     

核酸分子的化学发光标记和化学发光检测

非同位素标记是核酸分子杂交和检测的关键技术,在已知的各种非同位素标记检测方法中,化学发光标记和检测以其灵敏度高,安全无害和操作简便等优点,愈来愈受到重视,本对核酸分子的化学发光标记和核酸杂交分子的化学发光检测作一简要介绍。     

MTT比色法测定促肝细胞生长物质对肝细胞生长的刺激活性

本实验建立了用简便的ＭＴＴ比色法对促肝细胞生长物质的促肝细胞增殖作用的测定方法,确定了实验的最适条件。与传统的３Ｈ ＴｄＲ掺入法进行比较的结果显示,ＭＴＴ比色法与３Ｈ ＴｄＲ掺入法测定结果基本相符,灵敏度相近,但消除了同位素的污染,是一个测定促肝细胞生长物质刺激肝细胞增殖活性的简便方法。     

应用鞣化载体酶联金葡菌A蛋白的“ELISA”法检测抗核抗体的研究

本文报告用鞣化载体酶联 A 蛋白的“ELISA”法检测 DNA 抗体的研究。以OD 值492nm>0.14为阳性,对60例正常人和104例自身免疫病、心血管病及非免疫性疾病患者的1:25倍稀释血清进行了检测。上述同样标本也用免疫荧光法检测进行比较。酶标法阳性率为69.1%,荧光法阳性率为47.6%,提示酶标法比荧光法有较高的敏感性。本文也对其影响因素进行了探讨。结果显示该法对检测抗核抗体是一种简便、快速、特异、敏感的方法,其 OD 值的测定又具有定性与定量的双重     

放免法用于检测基因工程防龋疫苗抗体的研究

用国产^125I同位素,以氯胺T氧化法,标记变链菌GTF抗原,其放射碘利率率＞40％,放化纯度＞95％,所得标记物置－20℃120d或4℃60d仍可使用。采用放免疫法检测基因工程防龋疫苗免疫的家兔、鸡血清抗GTF抗体和卵黄抗GTF抗体,结果提示,该法是一种特异性强,灵敏度高,重复性和稳定性好的检测方法。     

胶体金免疫层析法快速检测沙门氏菌

为了建立一种简便快速的胶体金免疫层析法(GICA)用于检测沙门氏菌,将抗沙门氏菌多抗用抗原吸收法封闭与其他肠道杆菌的交叉反应,标记胶体金溶胶制成探针,采用多膜复合的方法制成免疫层析条。结果表明该层析条灵敏度为2.1×106cfu/ml,不与其他肠道杆菌反应,37℃放置33天,检测结果无差异。该方法灵敏度高,简便快速,无需特殊仪器设备,有良好的开发应用前景。     

用考玛斯亮兰G—250迅速,灵敏地测定蛋白质浓度

蛋白质浓度测定法是生物化学实验室最常用的方法,目前用得比较多的有双缩脲法、Folin酚法。对混有核酸的蛋白质则用260nm和280nm的紫外光吸收测定法。如果利用肽键在远紫外区(205 nm附近)的光吸收,受氨基酸组成分的影响较小,则可更精确地测定蛋白质浓度。比较这些方法的优劣时我们发现:双缩脲法灵敏度低;Folin酚法需要较多的试剂,过程比较复杂,不准确;280nm和260nm的光吸收测定法精度不高,对不含核酸的蛋白质的测定有局限性;远紫外光吸收测定精度高,但芳香族和蛋白质二级结构如α-螺旋、β     

5种常见植物DNA提取效率的比较

以小麦、玉米、甘蓝、花生、菠菜的幼嫩叶片为实验材料,采用高盐低pH值法、SDS法和CTAB法3种不同的DNA提取方法,提取其总DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度法对所得DNA进行比较分析.结果表明:玉米和菠菜采用SDS法提取基因组DNA效果明显优于CTAB和高盐低pH法.CTAB法对高脂肪花生的DNA提取,所得浓度较高.而高盐低pH值法建议减少使用.     

抗金葡萄球菌免疫核酸诱生细胞毒因子的研究

用抗金黄色葡萄球菌免疫核酸致敏家兔,发现兔血清中含有直接杀伤L929细胞的细胞毒因子。就其成分进行了探讨,推测其中主要成分为肿瘤坏死因子(TNF)。并可有淋巴毒素及起协同作用的少量干扰素等其他一些成分。分别用体外细胞毒实验即结晶紫染色法及地~125I—UDR掺入法,计算细胞毒指数,评估结果,对两种检测手段进行了比较,染色法虽不如同位素法灵敏度高,但无放射性污染、不易保存等缺点。应用放线菌酮可以使细胞毒作用放大,便于检测到较微弱的细胞毒活性,而且实验条件易于控制,结果也较稳定。     

大白鼠血浆皮质酮的竞争性蛋白质结合分析法

血浆皮质酮的测定方法很多,西尔佰(Silber,1954)报道的比色法,任克尔(Zenker,1958)报道的荧光法。彼得森(Peterson,1963)报道的双同位素衍生物法,沃尔菲利(Murphy,1967)、纽瑟姆(Newsome,1972)和卡梅伦(Cameron,1973)分别报道的竞争性蛋白质结合分析法以及戈梅斯-桑切斯(Gomez-Sanchez,1975)报道的放射免疫法等。其中以后二者的灵敏度和特异性为     

辣根过氧化物酶标记DNA探针及光增强检测DNA指纹图在法医应用的研究

本文介绍了用辣根过氧化物酶直接标记DNA探针,光增强检测DNA指纹图的技术,所得图谱清晰易读,分辨率高,灵敏度为0.8μg,接近~(32)P同位素标记的水平。就150名无关个体的DNA指纹图分析表明两个个体图谱完全相同的机率是3.7×10~(-14);方法稳定性测定表明,足以取代同位素标记,用作准确的个人识别和亲子鉴定,为侦破强奸、凶杀等案件提供重要科学依据,该法简便,快速,适用于各实验室,易于推广应用。     

固相DNaseⅠ足迹法研究DNA-蛋白质相互作用

传统的DNaseⅠ足迹法程序繁杂,并且要求目的蛋白经过一定程度的纯化.而固相DNaseⅠ足迹法通过结合有模板的磁珠,先富集序列特异的DNA结合蛋白,进行DNaseⅠ酶切,然后用测序胶分离并分析结果.此方法简便易行,重复性好,并减少了对操作者的放射性损害,尤其适用于研究未经纯化的核蛋白粗提物内序列特异蛋白.