克隆人TG700

大正制药公司克隆了人TG_(700)(TG:Taisho Growth inhibitor),以短芽孢杆菌Bacillus brevis为宿主生产重组TG_(700)获得成功。现在正用动物实验评价药效和安全性。该公司与某大学合作克隆出癌细胞株所产生的有用生理活性蛋白。TG_(700)抑制癌细胞增殖,促进正常上皮细胞的增殖,不仅作为抗癌剂而且也能应用于消化性溃疡和创伤的治疗等。     

大肠杆菌Ⅰ型分泌表达系统研究进展及提高蛋白表达量的策略

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主之一。利用大肠杆菌分泌途径胞外表达重组蛋白具有可促进蛋白正确折叠,有效减少包涵体形成,简化纯化工序等诸多优势,近年来备受关注。其中,大肠杆菌Ⅰ型分泌途径具有分泌表达速度快,蛋白活性高,对宿主代谢无影响等特点,是目前应用最广泛的分泌途径之一。综述了大肠杆菌Ⅰ型分泌系统的元件组成和分泌机理及提高Ⅰ型分泌系统蛋白表达量的有效策略,为重组蛋白生产应用提供了理论依据。     

大肠杆菌I型分泌表达系统研究进展及提高蛋白表达量的策略

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主之一。利用大肠杆菌分泌途径胞外表达重组蛋白具有可促进蛋白正确折叠,有效减少包涵体形成,简化纯化工序等诸多优势,近年来备受关注。其中,大肠杆菌I型分泌途径具有分泌表达速度快,蛋白活性高,对宿主代谢无影响等特点,是目前应用最广泛的分泌途径之一。综述了大肠杆菌I型分泌系统的元件组成和分泌机理及提高I型分泌系统蛋白表达量的有效策略,为重组蛋白生产应用提供了理论依据。     

利用新酵母开发效率高的人蛋白的分泌系

日本一公司宣布利用分泌能力强于传统的酿酒酵母力的酵母克鲁维酵母,着手开发人蛋白的分泌系。该公司的母公司西德 Hoechst 公司用酿洒酵母的分泌系生产粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。如果能开发有望的系,将来该公司的生物药品生产系也有可能采用新开的有望系。     

破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株构建

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良, 构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌, 该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的S. aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至E. coli BL21(DE3)的lpxM位点, 改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间, 这样可使宿主核酸免受该酶“毒性”影响, 菌体裂解后, nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。     

91年12月销售重组胰岛素

新北欧药物公司在12月销售5种重组人胰岛素制剂。这是用美国Zymogenetics公司开发的酵母为宿主,利用基因操作技术制造的。该公司现也已申请引进配合型和注射制剂等,1992年将胰岛素制剂更换成重组人胰岛素,分割该公司和日本市场的盐野义制药公司、美国Eli Lilly公司从1986年销售重组人胰岛素。日本决定1992年用基因操作技术制造胰岛素。丹麦Novo Nordisk公司开发用蛋白分解酶将猪胰岛素(有一个氨基酸序列与人的不同)变换成人型的制造     

大肠杆菌-分枝杆菌分泌型穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65的构建及人结核杆菌HSP65的表达

用PCR技术从Bacillus Calmetteguérin(BCG)基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽(SP)DNA序列,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG2100的人结核杆菌HSP70启动子下游,构建成分泌型原核穿梭表达质粒(pBCGSPHSP65)。酶切鉴定、PCR和测序分析结果均表明分泌型原核穿梭表达质粒pBCGSPHSP65构建成功。利用电穿孔将该质粒转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterial smegmatis, MS)中,用卡那霉素筛选出阳性重组子。经热诱导后用SDS-PAGE观察到在耻垢分枝杆菌中65kD蛋白占总蛋白的20%,而在重组耻垢分枝杆菌表达的65kD蛋白占菌体总蛋白的34.46%,占裂解物上清总蛋白的68.56%,表明重组的HSP65基因能在耻垢分枝杆菌中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合,说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性。     

重组蛋白在大肠杆菌周间腔的分泌表达

大肠杆菌是用于生产重组蛋白的重要工程宿主菌。但是,要获得足够的正确折叠的蛋白还存在一定的缺陷,其中一种解决此问题的方法就是使重组蛋白分泌到大肠杆菌的周间腔里。在这篇综述中,主要讨论了使重组蛋白分泌表达至大肠杆菌周间腔的近期的研究进展。     

荷Unilever公司利用酵母菌代替大肠杆菌作宿主

荷兰Unilever公司进行了产醇氧化酶的酵母多形汉逊酵母(Hansenula Poyforma的应用开发,用它代替大肠杆菌供重组蛋白克隆用的宿主。该公司的生物科学研究所Theo Verripe主任研究员为首的小组用多形汉逊酵母先进行了食品工业用重组蛋白的克隆。     

芽胞杆菌中重组蛋白分泌表达的优化策略及研究进展

芽胞杆菌属具有良好的蛋白表达和分泌能力,在工业酶的生产中被广泛应用,是理想的工业宿主菌,但实现蛋白分泌表达的普遍高效性还存在许多瓶颈。本文综述了芽胞杆菌的蛋白分泌表达策略,从启动子、信号肽、分泌途径、宿主和培养条件这5个方面总结了提高芽胞杆菌中分泌表达重组蛋白的方法,对芽胞杆菌高效生产工业酶有一定的参考价值,最后展望了优化芽胞杆菌分泌表达的研究方向,各种新型生物技术的发展必将推进芽胞杆菌在分泌表达领域有更深入的应用。     

基因设计对重组蛋白表达的影响研究进展

利用异源表达系统生产重组蛋白已成为现代基因工程和生物工程研究热点和重点。但是研究者发现并非所有的基因都能在异源宿主中高效表达,除了宿主、分泌途径、启动子等因素外,基因自身的序列也蕴含了多种影响蛋白表达的因素,如密码子偏爱性,密码子对偏爱性,GC含量,mRNA二级结构,mRNA稳定性等。从基因设计的角度对影响蛋白表达的因素和方法进行了综述,尤其是对密码子优化和密码子对优化,详细讨论了与传统基因优化理念截然不同的密码子协调化及密码子对协调化等最新进展。     

人肿瘤坏死因子在鱼腥藻7120中的表达

肿瘤坏死因子(TNF)是一种应用广泛及疗效肯定的抗肿瘤细胞因子。目前基因重组TNF主要以大肠杆菌为宿主进行发酵生产,由于大肠杆菌自身含有毒蛋白,表达的重组TNF如不经严格的分离纯化,其临床应用毒副反应明显。此外,大肠杆菌的生长需要较贵重的有机物和生化制剂,从而使在大肠杆菌表达的重组TNF的纯化工艺复杂、成本较高。蓝藻是光合自养生物,结合简单、生长迅速、适应性强、易于进行遗传操作,且多数不含毒蛋白。利用蓝藻为宿主,进行重组TNF的生产,具有减低生产成     

用植物细胞生产重组蛋白

京都大学水学部植物病理学教授古泽(?)男等小组利用一种花叶病毒(BMV),在植物细胞大量生产重组γ干扰素(IFNγ)(全蛋白量的10%)成功。用再现的植物体追试这项结果,可开发在大田生产重组蛋白的分子农业。该氏估算完成这项技术制造重组蛋白每1克约2～3日元。分子农业是比利时 PlantGenetic System 公司提倡的技术,1989年该公司利用油菜籽白蛋白基因,生产低分子的脑内肽获得成功。麒麟啤酒公司与帝京大学共同以烟草花叶病毒为载体用烟草生产脑啡肽。用这种方法只能生产5个氨     

用酵母分泌表达味觉变革蛋白

研究将酸味变成甜味等修饰味觉的蛋白(味觉变革蛋白)的横滨国立大学教育部教授栗原良枝等小组着手研究用基因重组酵母分泌表达味觉变革蛋白奇异果素、葡糖醛酸。奇异果素是与东燃公司,葡糖醛酸是与旭电化工业,东京大学农学部教授荒井综一共同开发的。4月2日在日本农艺化学会上发表了用大肠杆菌表达重组基因的成果,但是用重组大肠杆菌表达的蛋白都没有味觉变革活性。目的是用酵母分泌表达,获得活性型蛋白。为味觉变革蛋白的结构活性的解明和大量生产开辟道     

提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白的研究进展

大肠杆菌是表达重组蛋白的常见宿主之一。重组蛋白分泌到周质空间或胞外培养基中较之在胞内以包含体形式表达有许多优势。主要讨论大肠杆菌Ⅰ、Ⅱ型分泌机制,并总结近年来在提高重组蛋白分泌表达的策略方面取得的进展。     

MHF组蛋白折叠复合体组分编码基因MHF1过表达对重组酿酒酵母纤维素酶生产的影响

【背景】重组酿酒酵母可用于生产多种药用蛋白和工业酶等外源蛋白,但蛋白分泌水平低是限制其异源蛋白高效生产的重要因素。异源蛋白表达和分泌过程可能会对宿主细胞产生多种胁迫,因此,研究胁迫响应相关基因对重组酵母异源蛋白生产的影响具有重要意义。Mhf1p是MHF组蛋白折叠复合体的组分之一,与DNA损伤修复及维持基因组稳定性有关,但其对异源蛋白生产的作用尚不清楚。【目的】研究MHF1过表达对重组酿酒酵母蛋白生产的影响。【方法】在分泌表达纤维素酶的重组酿酒酵母菌株中利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术整合过表达MHF1,分析其对产酶的影响,并探讨影响产酶的分子机理。【结果】与出发菌株相比,过表达MHF1菌株的外切纤维素酶CBH酶活性提高了38%。对过表达MHF1的CBH生产菌株中蛋白合成和分泌途径相关基因转录水平进行检测,发现与对照菌株相比,CBH1基因和与分泌相关的SEC22、ERV29等基因在不同时间点呈现不同程度显著上调。【结论】MHF1过表达可促进酿酒酵母异源外切纤维素酶的生产,并影响外源酶基因和分泌途径基因的表达,可能通过对多基因的协同表达影响促进产酶。     

鲤鱼生长激素和对虾白斑病毒囊膜蛋白VP28的融合表达及功能研究

鲤鱼生长激素GH是鲤鱼生长腺体分泌并促进鲤鱼生长的一种分泌蛋白.对虾白斑综合病毒(WSSV)VP28蛋白为囊膜蛋白,是病毒感染宿主的必需因子.根据gh和vp28的上下游序列,分别设计合成两对引物,PCR扩增gh和vp28基因,将基因gh和vp28按先后次序融合后插入穿梭质粒pPIC6αC多克隆位点,构建成重组分泌表达穿梭质粒pPIC6αC-(gh vp28),用Bstx1单酶切穿梭质粒pPIC6αC-(gh vp28)线形化,转化毕赤酵母X-33.重组菌株30℃甲醇诱导,实现在酵母中的融合分泌表达,获得融合蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测和Western Blot印迹鉴定,显示与预期大小66kD相吻合的融合蛋白带.用Ni2 -柱纯化后的基因工程蛋白注射鳌虾进行蛋白生物功能测试,结果表明该蛋白获得了促鳌虾生长和抗WSSV感染的双重功效.     

大肠杆菌中的蛋白质分泌

目前,在微生物遗传工程中应用的表达载体大多是指导目的基因在宿主的胞质中表达,尽管外源蛋白的产量可达菌体总蛋白的50％以上,但同时也存在不少缺点:(1)高水平表达的外源蛋白容易发生沉降、凝聚,难以重新折叠为正确构象,不易获得有功能的产品;(2)产品纯化工艺复杂;(3)对宿主有毒性作用,导致表达体系不稳定;(4)外源蛋白易被胞内蛋白酶降解。这使得微生物遗传工程的应用受到很大限制。 如果能使在胞质表达的外源蛋白分泌到胞外,既可纠正由子高表达所引起的种种不利。近十年开展了对E.coli中蛋白质定位的深入研究。E.coli的蛋白质最初都是在胞质合成的,通过分泌而定位于膜或周质。例如外膜蛋白A(OmpA)先以前体形式在胞质合成,然后借助信号肽的作用穿过内膜,在分泌过程中信号肽被切除成的成熟蛋白定位子外膜。现在许多作者利用E.coli分泌蛋白的信号肽序列与目的基因相融合,将外源蛋白分泌出胞质。如用碱性磷酸酶(phoA)的信号肽分泌人α干扰素,使产物的稳定性和产量都有所提高,并且可通过简单的物理技术得到产品。E.coli溶血素通过特殊的分泌机制穿越细胞膜分泌至培养基,现已尝试用该系统构建表达载体。 本文从信号肽的作用、成熟蛋白对分泌的影响、宿主在分泌中的作用、E.coli溶血素的分泌以及外源蛋白在E.coli中的分泌等几方面综述近几年研究E.coli蛋白质分泌的进展。     

Novo公司在美国开始生产重组酶

丹麦Novo Nordisk公司继日欧之后,也在美国开始利用重组微生物生产酶.Novo Nordisk公司的美国法人Novo Nordisk Biochem公司整顿了重组酶的生产体制. Novo公司最初在美国生产的重组酶是用于淀粉工业和纤维工业的耐热性α-淀粉酶.用生产菌芽孢杆菌属菌株的基因重组提高了产物的产率. 该公司去年10月就重组菌用于工业生产这一专题邀请了工厂所在社区的居民和立法、行政当局召开了约60人的说明会.     

用20升培养物生产5克降钙素

三得利公司确立了一种基因重组法,可大量生产酰胺化的人降钙素(hCT),结果在4月东京召开的日本农艺化学会上发表.使用基因重组生产的α酰胺化酶作用于用基因重组大量生产的目的蛋白,获得活性蛋白.用20升培养物能制造4～5克酰胺化活性型hCT.用这项技术还能大量生产由于酰胺化而产生活性的其它蛋白.三得利公司最近打算向厚生省申请批准生产hCT. hCT的生产程序如下:首先用基因重组大肠杆菌生产与融合有β半乳糖苷酶片段的蛋白,然后用蛋白酶V8切出hCTGKKR(hCT-Gly-Lys-Lys-Arg),用羧肽酶B将其变换成