鼠伤寒沙门氏菌多重PCR检测方法的研究

分别根据沙门氏菌16S rRNA、质粒毒力基因spvC、致病基因invB、fimA序列设计4对引物,对沙门氏菌株及非沙门氏株菌基因组DNA进行多重PCR检测。结果该方法能检测出6.3×10² 个cfu/ml纯培养的沙门氏菌,人工染菌食品模拟检测结果显示,熟鸡肉初始含菌量为17cfu/g、全脂奶粉为11cfu/g、生牛肉为13.6cfu/g,经过8h增菌,PCR检测为阳性。该体系能鉴定产生多种毒力因子的沙门氏菌,特异性强、敏感性高,为检测和鉴定沙门氏菌株提供了一个新方法。     

弗氏志贺菌毒力大质粒导入大肠杆菌MG1655

目的:将弗氏2a志贺菌2457T的毒力大质粒pSF导入大肠杆菌MG1655。方法:通过诱动转移技术,将弗氏2a志贺菌2457T的毒力大质粒导入大肠杆菌MG1655。结果:构建了MG1655/pSF:pXL275-virG的毒力大质粒导入突变株,双向电泳初步比较分析表明在重组MG1655中有志贺菌毒力的表达。结论:成功地将弗氏2a志贺菌2457T毒力大质粒pSF导入了大肠杆菌MG1655。     

一株牛源都柏林沙门氏菌的全基因组测序及毒力与耐药性分析

【背景】沙门氏菌(Salmonella spp.)是重要的人畜共患病原菌,其毒力和耐药性的不断增强引起广泛关注。【目的】了解从通辽市一犊牛死亡病例中所分离牛源都柏林沙门氏菌的毒力及耐药性情况。【方法】以病死犊牛肺脏为材料,经细菌分离纯化及16S rRNA基因测序,鉴定病原为沙门氏菌。采用动物试验、药敏试验和PCR方法对分离菌进行毒力、耐药性,以及毒力基因和耐药基因检测,并对其进行全基因组测序分析。【结果】分离菌具有较强毒力,对小鼠半数致死量为2.8×10⁶ CFU/mL。分离菌为多重耐药菌,仅对多粘菌素B和噻孢霉素敏感,对强力霉素和恩诺沙星中度敏感。检测13种沙门氏菌常见毒力基因,检出率为92.3%。对分离菌进行全基因组测序分析,该菌株为都柏林沙门氏菌,基因组大小为4 965 370 bp,GC含量为52.12%,同时携带2个质粒,大小分别为79 524 bp (pTLS-1)和45 301 bp (pTLS-2)。分离菌中共携带996个毒力基因和24个毒力岛;共携带42个耐药基因,其中4个为可水平转移基因,基因组中存在9个可移动遗传元件,包括插入序列和转座子等。【结论】分离牛源都柏林沙门氏菌菌株具有较强毒力且为多重耐药株,携带大量毒力基因及耐药基因。     

福氏2a痢疾菌ySH6000的1400Md侵袭性质粒:逃避宿主细胞的杀伤再感染相邻细胞所需的一个操纵子

<正> 由志贺氏菌引起的细菌性痢疾早期必经阶段是侵入肠上皮细胞,在那里增殖并且再感染邻近的细胞。大质粒(230kb)至少和染色体三个部位与福氏痢疾菌的毒力有关。志贺氏菌的毒力是很不稳定的。这是由于质粒遭受巨大缺失式ISl插入所致。质粒的分子改变可同时引起毒力的各种表型如小鼠毒力试验(Ser),侵入组织培养细胞(Inv),刚果红结合(Pcr),细菌生长抑制(Igr)和接触溶血(Chl)等全部丧失。该质粒经SalI裂介后进行琼脂糖凝胶电泳,并把SalI部分裂介片段克隆,以进行Sael裂介图谱分析。发现50kb片段上有2个位点,之一相当于以前用Pcr决定子克隆到大肠杆菌K12中,     

小肠结肠炎耶尔森氏菌依温毒性的研究

本文报告了来自不同国家和地区的人和动物的80株小肠结肠炎耶尔森氏菌的自凝性和血清抵抗性,并与前文报道的依钙性和毒力质粒对比。带毒力质粒的菌株均37℃阳性和25℃阴性,而无毒力质粒的菌株37℃和25℃均阴性。从而指出,带毒力的小肠结肠炎耶尔森氏菌有温度依赖的特性。同时证实,62株地方分离株均为毒力株,具有致病性。本文采用的自凝性和血清抵抗性试验方法具可靠、经济、快速和应用广泛等优点。     

基因转移至小肠结肠炎耶氏菌的遗传途径

小肠结肠炎耶氏菌(Yersinia enterolitica)是一种人畜共患腹泻病病源菌。1939年在美国首次被发现。1980年Zink等人从小肠结肠炎耶氏菌中发现一种毒力质粒(Virulence plasmid)。此质粒编码多种性状。关于毒力质粒的酶切分析及基因定位等均有报道。本文报道了一种具有广泛寄主范围的质粒pKT230在诱动质粒pRK2013的帮助下被诱动转移至小肠结肠炎耶氏菌中。这一工作为进一步在小肠结肠炎耶氏菌中进行外源基因的克隆和表达的研     

一种溶菌酶样蛋白对肺炎链球菌毒力及荚膜多糖合成的影响

摘要：【目的】为了研究肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）的一种假想的溶菌酶样蛋白在细菌生物学性状及其致病中的作用。【方法】利用长臂同源PCR对该基因进行敲出,并同时构建带有拯救质粒的缺失菌株,观察D39野生菌、缺失菌与带有拯救质粒的缺失菌株在相关生物学性状及其致病力改变,从而鉴定这种假想溶菌酶样蛋白的功能。【结果】缺失菌与野生菌相比,细菌生长减缓,毒力下降,荚膜多糖合成明显减少。而将拯救质粒转入缺失菌株后,该溶菌酶样蛋白的mRNA表达水平较野生菌高,其毒力及荚膜合成     

鼠伤寒沙门氏菌asd基因的克隆及序列分析

以鼠伤寒沙门氏茵标准株基因组DNA作为模板,用PCR的方法扩增鼠伤寒沙门氏菌的asd基因并克隆入质粒pUCl9,并对其进行测序,序列与献报道一致。同时将质粒pYA248上的链球菌asd基因进行了置换,观察了分别含有链球菌asd基因与鼠伤寒沙门氏菌asd基因的质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌X4072中的生长情况,结果表明含有鼠伤寒沙门氏菌的asd基因的高拷贝质粒pUCl9的菌株生长情况更好。为完善染色体／质粒平衡致死系统,构建减毒鼠伤寒沙门氏活菌疫苗奠定了基础。     

一种基于温敏质粒的新型基因敲除方法

基于温敏型质粒而不用线性DNA的方法用于快速敲除沙门氏菌染色体上的目的基因。以伤寒沙门氏菌S.ty2基因组为模板扩增得到的ssaV基因的上下游同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段连接到温敏型质粒pHY304,共同构建同源重组载体;然后转化S.ty2,通过筛选得到带有抗性标记的重组菌。通过转入重组酶表达质粒pCP20,去除抗性标记,得到ssaV基因缺失的重组菌,并在 DNA 水平进行了鉴定。建立了一种改进的基于温敏质粒的沙门氏菌的基因敲除方法,此方法也值得在其他革兰氏阴性菌的基因敲除中尝试应用。     

耶氏菌属Yop蛋白的致病性

对人致病的耶氏菌有３种：鼠疫,假结核及小肠结肠炎耶氏菌,它们在一定条件一可合成和分泌一组毒力因子以及与毒力有关的因子,总称为Ｙｏｐ蛋白,这些蛋白在致病性及毒力调节方面有重要意义。Ｙｏｐ蛋白主要有两类：一类具有抗缩主功能,如ＹｏｐＭ和ＹｏｐＥ;另一类主要直调节作用,如ＹｏｐＮ／ＬｃｒＥ,ＹｏｐＤ,ＬｃｒＧ及ＬｃｒＱ。ＬｃｒＶ与ＹｏｐＨ兼有上述２种功能。编码Ｙｏｐ的基因位于７０－７５ｋｂ的质粒上。通过     

重组质粒在减毒沙门氏菌中的稳定性及其对细菌侵袭力的影响

将含有外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3-F和pCI-F转化减毒鼠伤寒门氏菌,探讨质粒类型和插入片段对重组质粒在细菌内的稳定性和细菌侵袭力的影响。结果表明,外源质粒可降低减毒沙门氏菌在体外的增殖能力和侵袭力,也影响细菌在鸡体内的存活力;就质粒类型而言,pCI的影响大于pcDNA3,而以携带外源基因的重组质粒影响较为显著;外源基因插入也影响质粒在宿主菌内的稳定性。提示利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗研究时,要考虑质粒类型与其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题。     

致肝脓肿高毒力肺炎克雷伯菌的表型及分子特征

目的 探究导致肝脓肿高毒力肺炎克雷伯菌的分子特征。方法 用VITEK-2细菌鉴定仪鉴定2014年1月至2016年1月丽水市中心医院肝脓肿患者脓肿穿刺液中分离的细菌。应用拉丝试验鉴定菌株的高粘性,用多位点序列分型（MLST）和血清型分型（K分型）对菌株进行分子分型,并用S1核酸酶脉冲场凝胶电泳（S1-PFGE）对菌株质粒谱进行分析。结果 57例肝脓肿患者接受肝脏脓肿穿刺引流并做脓液培养。44例患者的脓液培养到不同的致病菌,培养阳性率为77.2%。在培养到的44株病原菌中,其中2株为大肠埃希菌,产酸克雷伯菌、金黄色葡萄球菌各1株,而肺炎克雷伯菌为40株,占肝脓肿致病菌的90.9%。40株肺炎克雷伯菌中,拉丝阳性率为67.5%（27/40）,K1为主要血清分型,占62.5%（25/40）,其次为K2型,占17.5%（7/40)。ST23为主要ST分型,占47.5%（19/40）,其次为ST86和ST65,各占7.5%（3/40）。同时发现一些未报道过的致肝脓肿肺炎克雷伯菌新ST分型,如ST218、ST1941、ST76、ST2159、ST660和ST485。40株致肝脓肿肺炎克雷伯菌中总共检测到12种质粒谱,包括带有一个质粒、多个质粒或不带质粒的谱型。其中带有一个近220 kb的质粒谱为主要谱型,共涉及19株菌,占47.5%,12株菌带有一个质粒,大小为140~250 kb。4株菌带有2个或3个质粒,5株菌不含有质粒。结论 拉丝试验和血清学分型不能鉴定所有的高毒力肺炎克雷伯菌;高毒力肺炎克雷伯菌很多为ST23型,但其进化整体上较为分散;高毒力肺炎克雷伯菌菌株可以不携带质粒。     

鼠疫耶尔森氏菌质粒上重要毒力相关基因的克隆与表达

鼠疫耶尔森氏菌含有3种质粒pMT1、pPCP1和pCD1,这3种质粒编码鼠疫耶尔森氏菌的多种重要毒力因子。首先通过生物信息学技术选定了18种可能重要的毒力相关基因作为拟克隆和表达的目的基因。通过：PCR技术、TA克隆技术、双酶切技术获得目的片段。这些目的片段再分别克隆入原核表达载体pET32a中,构建了一系列重组表达质粒,其中12个重要的毒力相关基因在原核表达载体pET32a中有稳定的高效表达,表达量占细菌总蛋白的20％～40％。实验结果为进一步研究质粒编码的毒力因子的结构与功能,及其作为新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

志贺菌毒力大质粒大片段敲除方法的建立

目的:构建志贺菌毒力大质粒大片段缺失突变体库。方法:首先利用λ-Red重组系统构建弗氏2a志贺菌301株毒力大质粒特定位点缺失株,再在距离此位点20 kb处缺失另一突变位点,最后根据重组酶识别远端FRT位点的特性,将两个远端FRT位点之间的DNA序列全部缺失。结果:敲除了毒力大质粒24 kb的DNA序列。结论:利用λ-Red重组系统及FLP-FRT位点特异性识别重组系统可以对志贺菌毒力大质粒逐步进行大片段的敲除,构建大质粒大片段缺失突变体库。     

用体内激活的启动子调控HCV核心抗原表达可增强重组鼠伤寒沙门氏菌的免疫原性

为提高抗原表达质粒在重组伤寒沙门氏菌中的稳定性以增强重组伤寒沙门氏菌诱导的免疫应答 ,克隆鼠伤寒沙门氏菌pagC基因启动子 ,以其为转录调控元件构建HCV核心抗原表达质粒 ,转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌中。体外培养时 ,Mg2 能够剂量依赖性抑制该重组菌表达HCV核心抗原。将该重组菌和组成性表达的重组菌分别口服接种BALB/c小鼠 ,观察质粒的稳定性和小鼠的免疫应答。结果表明 ,体内激活的pagC基因启动子能明显提高质粒在重组鼠伤寒沙门氏菌中的稳定性和增强重组菌诱导的体液和细胞免疫应答 ,这为发展高效免疫、成本低廉的口服丙肝疫苗提供了一个新思路     

一株猪源鼠伤寒沙门氏菌的耐药性鉴定及其消除

猪源鼠伤寒沙门氏菌临床分离株17Y,检测其对19种抗生素的耐药性,结果耐14种抗生素。用高温及高浓度SDS处理后,获得对11种抗生素的敏感性,该菌株命名为17S1。PCR检测证明,大部分耐药基因存在于质粒上,包括I型整合子携带耐药基因,且随着质粒的消除而被消除。所鉴定的耐药基因有blaTEM、blaOXA-1、cat1、tet(B)、aacC2、aadA8b、dhfrXⅡ和sul1等。喹诺酮类药物的靶基因gyrA与parC位于染色体上。GyrA在耐药决定区第87位氨基酸突变(N78D),导致了喹诺酮类药物的耐药性逆转。敏感菌中扩增不到质粒毒力基因spv与rck。耐药性消除后的菌株17S1对小鼠的毒力降低(LD50增加10倍),在小鼠体内的增长与散速度也显著降低(P<0.05)。以上证据表明,鼠伤寒沙门氏菌的多重耐药性主要由质粒决定,研究开发新型质粒消除剂将对克服鼠伤寒沙门氏菌多重耐药性具有重要意义。     

宋内Ⅰ相抗原和霍乱CT-B共表达的免疫保护效果观察

将编码宋内氏痢疾菌(Shigella sonnei)I相O抗原的基因和霍乱弧菌(Vibrio choler-ae)的CT-B基因克隆至带asd基因的质粒PYA248,得重组质粒PMGL105。将该重组质粒转入asd基因缺失的减毒伤寒沙门氏菌X4072,构成了一个不带抗药性基因的载体-宿主平衡致死系统。一系列实验表明,该重组菌X4072(PMGL105)能稳定地表达宋内I相O抗原和霍乱弧菌的CT-B抗原。小鼠免疫保护实验表明,该重组菌对有毒的宋内氏I相痢疾杆菌及霍乱弧菌的攻击均具有良好保护作用。     

肺炎克氏杆菌固氮基因在稻根联合固氮菌粪产碱菌中的转移和表达

pRD1是带有肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)固氮基因的重组质粒,它可以通过细菌间的接合转移到大肠杆菌(Escherichia coli)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、草生欧文氏菌(Erwinea herbicola)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)和棕色固氮菌(Aztobacter vinelandii)中,所带的固氮基因能在其中的一些菌株中表达。 本文报道pRD1质粒在稻根联合固氮菌粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)A-15中转移和表达的情况。     

志贺菌福氏2a毒力大质粒DNA全序列的测定与基因分析

对志贺菌福氏2a 301株的毒力大质粒pCP301的DNA全序列进行了测定, 并进行了结构分析. 结果表明, pCP301 DNA全序列由221618个碱基对组成, 基因分析共确定了272个开放读码框架(ORF), 经过与基因数据库比较, 其中194个ORF与已知基因或编码产物具有高同源性, 61个ORF同源性较低, 其余17个为新确定的未知功能的ORF. pCP301中的基因主要包括: (ⅰ) 与细菌毒力有关的ipa-mxi-spa, osp和iph基因; (ⅱ) 与调控有关的vir基因; (ⅲ) 与质粒的维持、稳定和DNA代谢有关的mvp, stb, rep和par等基因; (ⅳ) 转座酶编码基因. pCP301中的插入序列总长68 kb, 占全序列的 30%, 提示pCP301在细菌生长与进化过程中发生了多次基因重排. 研究结果对揭示志贺菌的致病机理及大质粒的遗传与进化有重要意义.     

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。