内含子的位置不影响转基因的表达

内含子在转基因动物的基因表达中具有重要作用,以乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因５′区为调控序列,人基因组Ｇ－ＣＳＦ基因为目的片段,将ＷＡＰ基因第一内含子插入Ｇ－ＣＳＦ基因５′端,构建成转基因动物乳腺表达载体。将其直接注射到小鼠乳腺,在泌乳期表达出人Ｇ－ＣＳＦ。表明内含子在５′端的位置不影响转基因的表达,同时也表明内含子对表达有一定的作用。     

直接注射质粒DNA表达人G-CSF的研究(英文)

转基因动物研究发展至今,对于所构建的表达载体有效性如何,一直缺乏一个验证体系。由于转基因动物的建立较为繁琐复杂,投资大,因而直接用转基因动物去验证所用元件是不明智的。为此,我们采用小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因（２．６Ｋｂ）为调控序列,人ＧＣＳＦ基因组基因为目的片段,将ＷＡＰ笫一内含子置于ＧＣＳＦ基因５’端,构建成转基因动物乳腺表达载体ｐＩＮＧＧ（Ｆｉｇ．１）。将表达质粒直接注射到怀孕小鼠乳腺。于分婉第８天取乳汁进行ＥＬＩＳＡ检测。在泌乳期小鼠乳汁中检测出人ＧＣＳＦ,表达量达１５３２ｎｇ／ｍＬ（Ｔａｂｌｅ１）。具有一定应用前景。实验中发现：增加注射次数可以提供转染效率,但最佳注射次数仍需摸索。另外,如果换用复制型载体,整合与表达效率有可能大大提高。     

乳腺特异性表达172~（HIS）突变型p53转基因鼠的建立

ｐ５３基因突变几乎存在于所有人类肿瘤中,尤其与严重危害妇女健康的恶性肿瘤──乳腺癌关系密切。研究表明：野生型ｐ５３基因是抑癌基因,而突变型ｐ５３基因则是癌基因──呈显性负调控突变型。本研究首次构建了这种类型的１７２ＨＩＳ突变型ｐ５３基因的转基因鼠,用以研究ｐ５３基因突变与乳腺癌发生的关系。用重组ＰＣＲ法把小鼠ｐ５３基因的第１７２个密码子ＣＧＣ突变成ＣＡＣ（由编码精氨酸突变为编码组氨酸）,得到１７２ＨＩＳ突变型ｐ５３基固。将其插入到大鼠乳清酸性蛋白（ＷＡＰ）启动子与ＳＶ４０ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列之间。获得置于载体ｐＢＬ１１９（Ｆｉｇ．１）上的表达结构ＷＡＰ－１７２ＨＩＳｍｔｐ５３－ＳＶ４０。经过ＢｓｓＨＩＩ酶切,纯化该表达结构部分。通过显微注射,将其分别导入ＦＶＢ和Ｃ５７ＢＬ品系小鼠受精卵中,获得３２只Ｆ０代鼠。经ＰＣＲ鉴定,其中９只为转基因阳性鼠（Ｆｉｇ．２）。对其进行的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析（Ｆｉｇ．３）证实了ＰＣＲ的鉴定,并得出了每只鼠中整合的转基因拷贝数（Ｔａｂｌｅ１）。当这９只鼠哺乳第二天时,取乳腺制备ＲＮＡ,进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析,其中５只的乳腺中有转基因表达,其中３只呈较高水平表达（Ｆｉｇ．     

组织纤溶酶原激活剂突变体乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表 …

通过ＰＣＲ方法从羊肝总ＤＮＡ中获得了羊－β乳球蛋白（ＢＬＧ）基因第一和第二内含子,以羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５’区５ｋｂ为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体载体。对５４０枚小鼠受精卵进行显微注射,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测,获得６只整合有人Ｌａ－ｔＰＡ的转基因小鼠,整合率为３２％。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明,在一些转基因鼠乳     

RT-PCR测定组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)在转基因鼠乳腺表达的研究

利用所构建的乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体（Ｌａ－ｔＰＡ）载体．对５４０枚小鼠受精卵进行显微注射,经ＰＣＰ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测,获得６只整合有人Ｌａ－ｔＰＡ转基因小鼠．为了精确研究转基因在小鼠体内的表达,采用ＲＴ－ＰＣＰ方法测定转基因鼠在泌乳期１～２０ｄＬａ－ｔＰＡ基因的转录,结果表明,在转基因鼠乳腺的Ｌａ－ｔＰＡｍＲＮＡ水平在１０～１５ｄ最高,在２０ｄ时降为最低．外源基因在转基因小鼠乳腺的表达规律研究为未来利用转基因动物生产Ｌａ－ｔＰＡ提供依据     

HCV/HBV复合抗原基因的克隆、表达及免疫应答研究

为探讨ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合疫苗的可行性,将合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）复合多表位抗原基因ＰＣＸ与ＨＢｓＡｇ 基因连接成ＰＣＸＳ基因,与β－半乳糖苷酶（ＧＺ）基因融合后在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得表达．目的蛋白ＧＺ－ＰＣＸＳ可被抗－ＨＢｓ 及抗－ＨＣＶ 抗体所特异识别．ＧＺ－ＰＣＸＳ抗原皮下注射免疫ＩＣＲ小鼠后,诱发了较高水平的抗－ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲ／ＰＣＸＳ）口服免疫小鼠后,诱发了高水平的ＣＤ８＋ Ｔ细胞增殖反应及抗ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．所有免疫小鼠均未见明显的毒副作用．该研究揭示,ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合抗原可诱发特异性体液免疫及细胞免疫应答,而活菌苗口服可能是理想的免疫途径,为ＨＣＶ／ＨＢＶ 双价疫苗研究提供了一定的理论及实验依据．     

人ApoE转基因小鼠与TGE_（7－2） TGE_（7－3）转基因鼠系的建立

用含小鼠金属硫蛋白（ＭＴ－１）基因启动子与突变的人ＡｐｏＥ７基因的６．０ＫｂＤＮＡ片段作为目的基因制备转基因小鼠,利用显微注射法将目的基因导入４４１枚受精卵,移植于２０只假孕鼠,其中１５只受孕,共产仔鼠８０只,经ａ－３２Ｐ斑点杂交与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交法鉴定出两只整合有人ＡｐｏＥ基因的转基因雌鼠,其拷贝数分别为２和５。将两只首建鼠（雌性Ｆｏ代）与正常雄鼠交配,建立Ｆ１代转基因鼠系ＴＧＥ７－２和ＴＧＥ７－３,为进一步从整体上研究ＡｐｏＥ在脂质代谢中的作用以及ＡｐｏＥ与动脉粥样硬化和Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ病的关系创造条件。     

金属硫蛋白突变体的植物高效表达载体的构建及其在烟草中的表达

金属硫蛋白有α、β两个结构域（ｄｏｍ ａｉｎ）,其中α结构域优先结合Ｃｄ２＋ 和Ｈｇ２＋ ．小鼠αα突变体在大肠杆菌中已经构建并得到表达,其转基因植株已得到,可在Ｃｄ３００（３００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．为了进一步提高外源基因在烟草中的表达量,首先用ＰＣＲ 的方法设计引物,在基因翻译起始密码子ＡＴＧ 附近加入植物偏爱的碱基组合ＡＡＣＡＡＴＧ．另外,将该突变体基因插入具有双３５ Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）强启动子的植物双元表达载体ｐＧＰＴＶｄ３５Ｓ－ＢＡＲ中,获得了带有αα突变体的植物双元表达载体．通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草ＮＣ８９,获得了抗除草剂的转基因植株．经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 和蛋白Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测,证明了αα突变体在烟草中的嵌合与表达．抗重金属实验证明转基因烟草可以在Ｃｄ４００（４００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．     

优化mRNA翻译起始区提高人粒－巨噬细胞集落刺激因子在E．coli中的表达

人粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）是一种重要的造血生长因子．利用基因重组技术构建两个ｈＧＭ－ＣＳＦ的Ｅ．ｃｏｌｉ表达菌株,一个为在不改变氨基酸顺序的前提下,对ｍＲＮＡ翻译起始区核苷酸顺序进行优化突变（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ））,另一个为未突变的对照（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ））．经酶切电泳、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等分析鉴定,证明两者均能表达特异性的１４．６ｋＤｈＧＭ－ＣＳＦ,但ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ）的表达水平较ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ）提高了１．２６倍,占菌体总蛋白的１６．９％．ｍＲＮＡ翻译起始区二级结构预测分析表明,优化突变后生成自由能ΔＧ从原来的－１０．２提高至－９．４Ｋｃａｌ,ＡＵＧ从部分配对状态变为非配对状态．     

人DAF基因在转基因小鼠中的遗传与表达

为研究人ＤＡＦ基因在小鼠体内遗传与表达的规律,从质粒ｐＳＦＦＶ－ＤＡＦ分离出一段包含人ＤＡＦ基因的ＤＮＡ片段。采用受精卵显微注射法建立转人ＤＡＦ基因小鼠。提取出生小鼠的染色体ＤＮＡ,经Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交相结合确定首建转基因小鼠,并经Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ杂交研究人ＤＡＦ基因在转基因小鼠体内的遗传特征,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交确定其表达情况。小鼠受精卵经基因导入后,共生出２４只小鼠,其中４只被确定为首建转基因小鼠,整合率为１５％,在首建转基因小鼠两两交配生出的Ｆ１代小鼠中分别有７０％和７５％继续携带人ＤＡＦ基因。首建转基因小鼠中有１只小鼠在ＲＮＡ水平表达了人ＤＡＦ基因。可见,人ＤＡＦ基因整合入小鼠基因组中,并能够稳定遗传及表达。     

转基因小鼠乳腺表达G-CSF的研究

用PCR法从正常中国人脐带血提取总DNA作为模板,扩增出1.5 kb的人G-CSF基因组基因。序列分析证实其正确性。将其插入小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的起始密码子ATG前的KpnⅠ位点,使其受控于2.6kb的WAP调控序列,构建成乳腺表达载体pWGG。回收经EcoRⅠ酶切后的8.7kb片段用于显微注射。共注射1200枚受精卵,移植34受体母鼠,产仔鼠85只。经PCR检测和DNA印迹分析,证实获得两只整合有人G-CSF基因的雄性鼠,整合率为2.37％。建立的转基因鼠系表明,采用ELASA方法对F1代雌鼠乳汁检测,成功地表达出人G-CSF。表达量为120～250ng/ml。这一结果表明转基因的表达具有乳腺特异性。这为在大动物中实施转基因提供了依据。     

小鼠细小病毒非结构基因转基因小鼠的建立

为探讨小鼠细小病毒（ＭＶＭ）非结构蛋白在ＭＶＭ感染中的抗肿瘤作用,酶切表达质粒ｐＵＬＢ３２３８获取该非结构基因,通过显微注射法接种入小鼠受精卵内制备转基因鼠。共注射受精卵７２０枚,选取存活受精卵２２５枚植入假孕小鼠输卵管,产仔１４只。转基因小鼠尾部组织ＰＣＲ法ＤＮＡ检测证明,其中４只整合靶基因。整合转基因的４只Ｇ０代小鼠与正常Ｃ５７ＢＬ／５Ｊ小鼠配种均可生产整合靶基因的小鼠。ＲＴ－ＰＣＲ法ｍＲＮＡ     

Production of transgenic mice and rabbits that carry and express the human tissue plasminogen activator cDNA under the control of a bovine alpha S1 casein promoter

One-cell embryos from mice and rabbits were microinjected with a hybrid gene composed of 1.6 kilobases (kb) promoter/regulatory sequences of the bovine alphaS1 casein gene fused to the complementary DNA (cDNA) encoding for the human tissue plasminogen activator (htPA) and 3'untranslated sequences from rabbit beta-globin and SV 40 genes. Transgenic mice and rabbits that carry the htPA gene were obtained. In mice, 11 founder females were generated, and 6 of them expressed low levels (about 50 mug/ml) of htPA in their milk. Some of the transgenic mice showed rearrangements of the microinjected DNA sequences as judged by Southern blot analysis. A position-dependent expression of the transgene is suspected to occur. The only live-born founder transgenic rabbit obtained was a male, and it transmitted the transgene in a Mendelian fashion to F1 females, which expressed htPA at very low levels (8 to 50 ng/ml). Although the 1.6-kb bovine alphaS1 casein promoter that was used directs the synthesis of htPA specifically to the mammary gland, it may not be sufficient for a high level of expression.     

人尿激酶原乳腺定位转基因小鼠的建立

应用大鼠β乳酪蛋白基因的上游调控序列和人尿激酶原ｃＤＮＡ构建成功了乳腺定位表达载体．用显微注射的手段导入到受精卵的雄前核,从注射的３００枚受精卵中,１４０枚被移植到９只假孕的受体小鼠．结果从获得的子一代小鼠中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实,有３只转基因阳性的小鼠．     

实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠拷贝数

目的利用实时荧光定量PCR法鉴定转基因小鼠外源基因插入拷贝数。方法以TG-CARK转基因首见鼠为研究对象,选取小鼠的高度保守基因Fabpi为内参,利用绝对定量的实时荧光PCR法鉴定转基因小鼠拷贝数,并与传统的Southern blot方法的定量结果进行比较。结果实时定量PCR鉴定的转基因拷贝数与Southernblot法完全一致,三只TG-CARK首见小鼠的拷贝数分别为1,7,45。结论实时定量PCR技术具有高准确性、高稳定性、高通量和低成本的优点,是比传统杂交技术更好的鉴定小鼠转基因拷贝数的方法。     

Rabbit whey acidic protein gene upstream region controls high-level expression of bovine growth hormone in the mammary gland of transgenic mice

Transgenic mice were produced which secreted high levels of bGH into milk. The 6.3-kb upstream region of the rabbit whey acidic protein (rWAP) gene was linked to the structural part of the bovine growth hormone (bGH) gene, and the chimeric gene was introduced into mouse oocytes. bGH was detected by radioimmunoassay in the milk of all resulting transgenic mice. bGH concentrations in milk varied from line to line, from 1.0–16 mg/ml. This expression was not correlated to the number of transgene copies. In all lines studied, the mammary gland was the major organ expressing bGH mRNA during lactation. bGH mRNA concentrations were barely detectable in the mammary gland of cyclic females; they increased during pregnancy. These results show that the upstream region of the rWAP gene harbors powerful regulatory elements which target high levels of bGH transgene expression to the mammary gland of lactating transgenic mice. © 1995 wiley-Liss, Inc.     

牛乳铁蛋白肽转基因小鼠的构建

目的:探讨牛乳铁蛋白肽在转基因鼠乳汁中的表达及其抑菌活性。方法:将实验室构建并保存的包含山羊β-酪蛋白基因启动子和牛乳铁蛋白肽基因的乳腺特异表达载体PI-bcp-LfcinB,用Xho I和Nru I双酶切,得到含有全部表达盒的显微注射DNA片段,采用常规显微注射技术获得转基因小鼠。并通过对泌乳期转基因雌鼠乳腺组织的RT-PCR检测,确定了牛乳铁蛋白肽在mRNA水平的表达,同时利用琼脂板扩散法检测了转基因鼠乳汁中表达产物的抑菌活性。结果:获得了牛乳铁蛋白肽转基因小鼠,且转基因小鼠乳汁中能够表达具有抑菌活性的牛乳铁蛋白肽。结论:通过转基因动物乳腺可以获得具有生物活性的牛乳铁蛋白肽,为进一步研究抗菌肽转基因牛、培育抗乳房炎奶牛新品种以及通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产奠定了基础。