拟南芥中光信号系统中关键基因CRY1、CRY2和COP1启动子的表达模式分析

通过构建表达光信号系统关键基因CRY1、CRY2和COP1启动子与GUS融合基因的拟南芥转基因植株,并对转基因植株进行GUS组织化学染色的结果表明,CRY1、CRY2和COP1的表达模式不受光条件的调控,并且在各器官有广泛的表达。分别分析CRY1基因启动子在cop1突变体以及COP1基因启动子在cry1突变体遗传背景中表达模式的结果表明,CRY1和COP1在转录水平上不存在明显的相互调控关系。     

AtSTP3启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异表达研究

利用PCR技术从哥伦比亚型拟南芥基因组DNA中分离了AtSTP3绿色组织特异表达的启动子,序列分析表明,扩增片段(1774bp)与已报道序列的相应区域同源性达99.9%。将其与GUS报告基因融合在一起,构建了植物表达载体,并由农杆菌介导法导入水稻品种‘中花11’中。对转基因水稻植株中的GUS活性进行定性与定量测定结果表明,AtSTP3启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片中特异性表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,AtSTP3启动子表现出明显的组织特异性。     

拟南芥Atkin8a和Atkin8b基因表达特性

以拟南芥动蛋白(kinesin)kin-8家族的AtKin8a和AtKin8b这两个动蛋白基因作为研究对象,以组成型表达的肌动蛋白基因(Actin2)作为对照,利用半定量RT-PCR的方法,分析其在拟南芥各器官中的表达状况。结果表明:AtKin8a和AtKin8b基因主要在花器官中特异表达;随后克隆AtKin8a和AtKin8b基因启动子区域并与GUS基因融合,转基因植株花器官GUS染色表明:AtKin8a和AtKin8b基因的表达主要分别在胚珠、花药部位。由此推测它们可能分别在胚珠、花药发育过程中发挥作用。     

UDP-glucose:sterol glucosyltransferase: cloning and functional expression in Escherichia coli/

Steryl glucosides are characteristic lipids of plant membranes. The biosynthesis of these lipids is catalyzed by the membrane-bound UDP-glucose:sterol glucosyltransferase (EC 2.4.1.173). The purified enzyme (Warnecke and Heinz, Plant Physiol 105 (1994): 1067–1073) has been used for the cloning of a corresponding cDNA from oat (Avena sativa L.). Amino acid sequences derived from the amino terminus of the purified protein and from peptides of a trypsin digestion were used to construct oligonucleotide primers for polymerase chain reaction experiments. Screening of oat and Arabidopsis cDNA libraries with amplified labeled DNA fragments resulted in the isolation of sterol glucosyltransferase-specific cDNAs with insert lengths of ca. 2.3 kb for both plants. These cDNAs encode polypeptides of 608 (oat) and 637 (Arabidopsis) amino acid residues with molecular masses of 66 kDa and 69 kDa, respectively. The first amino acid of the purified oat protein corresponds to the amino acid 133 of the deduced polypeptide. The absence of these N-terminal amino acids reduces the molecular mass to 52 kDa, which is similar to the apparent molecular mass of 56 kDa determined for the purified protein. Different fragments of these cDNAs were expressed in Escherichia coli. Enzyme assays with homogenates of the transformed cells exhibited sterol glucosyltransferase activity.     

病程相关基因启动子片段与GUS的融合基因在拟南芥中的表达

PR1是拟南芥 (Arabidopsis thaliana L.) 系统获得抗性的一个标志基因。利用PCR技术,从拟南芥中扩增并克隆了PR1基因的启动子片段。将该启动子片段与GUS报告基因拼接,构建成含有PR1-GUS融合基因的重组表达质粒。经根癌农杆菌介导转化,得到了转基因的拟南芥植株。用已知的系统获得抗性激活剂处理转基因植物,检测到GUS活性。因此,这一转基因体系可以作为一种简便、灵敏的实验体系以筛选激活植物系统获得抗性的化合物。     

病程相关基因启动子片段与GUS的融合基因在拟南芥中的表达

PR1是拟南芥(Arabidopsisis thaliana L.)系统获得抗性的一个标志基因.利用PCR技术,从拟南芥中扩增并克隆了PR1基因的启动子片段.将该启动子片段与GUS报告基因拼接,构建成含有PR1-GUS融合基因的重组表达质粒.经根癌农杆菌介导转化,得到了转基因的拟南芥植株.用已知的系统获得抗性激活剂处理转基因植物,检测到GUS活性.因此,这一转基因体系可以作为一种简便、灵敏的实验体系以筛选激活植物系统获得抗性的化合物.     

白桦CESA7基因启动子的克隆与表达分析

克隆得到了一个白桦纤维素合成酶基因（CESA7）GenBanK登录号（EU591531）启动子序列,通过序列分析发现该启动子含有多个不同功能的顺式作用元件,包括光响应元件、激素响应元件、叶片形态发育元件等,推测该启动子在白桦生长发育过程中具有关键作用。将BpCESA7启动子克隆至带有GUS报告基因的植物表达载体,命名为proBpCESA7-121-GUS,并利用农杆菌介导方法侵染白桦和拟南芥,然后通过GUS组织化学染色观察BpCESA7基因启动子的组织表达特性。结果在白桦的根、茎、叶和拟南芥的根,叶,萼片、雌蕊中检测到了GUS活性,说明BpCESA7基因启动子具有启动子活性,并且在白桦的根和叶中染色最深,表明BpCESA7基因在白桦根和叶中表达量较高,并且其存在组织表达特异性。     

Auxin quantification based on histochemical staining of GUS under the control of auxin-responsive promoter

To visualize phytohormone localization in plant tissues, transgenic plants comprising the GUS reporter gene are often used. However, until now only qualitative assessment of the hormone presence was available. In this work, we suggested the method for IAA quantification in transgenic DR5::GUS Arabidopsis thaliana L. plants by the analysis of digital images. An empirical quadratic dependence was established between the IAA concentration in medium and the level of GUS-dependent staining. Using this method, we demonstrated that, after A. thaliana root gravistimulation for 90 min, auxin lateral redistribution occurred. It resulted in the increase in the IAA concentration in the lower root part (in the elongation zone and apical meristem) by 200% on the average.     

84K杨PagC3H3基因表达模式分析

木质素作为木材的主要组成成分;通常是由3种单体聚合而成;在其生物合成过程中;共有10个酶家族参与负责将苯丙胺酸转化为单体木质素;其中C3H是在对-香豆酰辅酶A（p-coumaroyl CoA）到咖啡酰辅酶A（caffeoyl CoA）的羟基化过程和G/S单体形成中的关键控制酶类;探究PagC3H3基因表达模式;对于进一步了解该基因功能具有重要意义。该研究通过定量PCR对PagC3H3基因的组织特异性表达进行分析;克隆得到了长度为2 035 bp的PagC3H3的启动子序列;预测含有多个顺式作用元件;同时;将获得的PagC3H3的启动子序列构建植物表达载体pBI121-PagC3H3pro::GUS;进行拟南芥瞬时转化;结果显示PagC3H3基因在84K杨的根、中部茎节和基部茎节中的表达量较高;瞬时转化拟南芥;GUS染色表明:在下胚轴和根中GUS活性较强;由此推测PagC3H3基因在木质素合成过程中发挥作用。     

pib基因启动子及其诱导启动性初探

将pib基因上游5.7 kb区段取代pCAMBIA1301中gus基因上游的35S启动子构建了pib拟启动区-GUS+ 35S-hpt 基因表达载体pNAR604。经农杆菌介导转化水稻成熟胚愈伤,获得了转基因抗潮霉素愈伤和36株转基因水稻植株。 转基因抗性愈伤和转基因植株根的组织化学GUS活性检测表明,光照培养下的抗性愈伤和转基因植株根不能使X-gluc显色,而暗处理24 h后的抗性愈伤和定植后转基因植株的根能使X-gluc显色。转基因植株GUS荧光定量分析结果表明,GUS表达具有器官特异性,黑暗处理前根的GUS活性最高、茎次之,分别是是叶片的7倍和3倍,叶片中仅有痕量本底。24 h黑暗处理后根、茎、叶中GUS活性都有增加,且叶片中的增加比例最大,其活性仅次于根。5 mmol/L水杨酸和0.3 mol/L NaCl叶面喷施转基因植株24 h后叶片中GUS活性分别为处理前的2.7和3.6倍。初步确定pib拟启动区是一个诱导型启动子。黑暗、水杨酸和NaCl能诱导该启动子启动活性。     

Organ-specificity and inducibility of patatin class I promoter from potato in transgenic arabidopsis plants

Patatin class I promoter (B33 promoter) is a tissue-specific potato (Solanum tuberosum L.) promoter expressing the patatin gene mainly in tubers. However, it can be induced in other organs by sucrose or light. We compared the activity of this promoter fused with the reporter gene during heterological expression in B33::GUS transgenic arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.) plants and homological expression of the same DNA construct in potato. Promoter activity was estimated from quantification of β-glucuronidase (GUS) activity. It was shown that, during heterological expression in arabidopsis seedlings, B33 promoter manifested a tissue-specificity and inducibility, although in a different manner than during homological expression in potato. In noninduced arabidopsis seedlings, B33 promoter was most active in the roots, whereas, after induction with sucrose treatment, it became most active in cotyledons. 10 mM sucrose was sufficient for a manifold activation of B33 promoter in intact seedlings. The degree of B33 promoter induction by sucrose in arabidopsis seedlings was strictly organ-specific and increased in the following sequence: root < hypocotyl < cotyledons. 150–200 mM sucrose enhanced B33 promoter activity in cotyledons by 200 to 300 times, i.e., much stronger than in potato organs. Glucose and fructose were less efficient than sucrose. Phytohormones affecting tuber formation in potato (gibberellins, auxins, and cytokinins) did not affect significantly B33 promoter activity in arabidopsis. A lag period of approximately 6 h preceded sucrose-induced B33 promoter activation. This indicates that the patatin promoter is not the primary target for the sucrose signal. The quantitative examination of heterological expression of patatin class I promoter further clarifies its basic functional characteristics and permits a better prognosis of its behavior after transferring into other plant species.     

拟南芥根特异表达基因启动子在烟草中的表达

以拟南芥为材料,利用PCR技术分离pyk10启动子序列,构建了该启动子GUS植物表达载体,农杆菌介导转化烟草,分析该基因在烟草中的表达,以明确拟南芥根特异表达基因pyk10启动子在烟草中的表达特性.结果表明:克隆的pyk10启动子与已报道的pyk10启动子一致性为100%,GUS基因在烟草的根部特异表达,表明该启动子为根部特异表达启动子,为揭示植物根的发生、分化和发育机制,以及培育抗根部病虫害和营养高效利用型转基因烟草奠定了基础.     

玉米AGPase基因启动子的克隆及鉴定

以玉米基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增得到了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGPase基因编码区上游1912 bp的启动子(AGPasep)序列.该序列包含TATA-box,CAAT-box等一些高等植物特有的启动子基本核心序列,推断其为一种新的启动子.为了验证该序列是否具有启动子功能,构建了含有此序列的植物表达载体pCAM-AGPasep,通过农杆菌介导法转化玉米愈伤组织进行瞬时表达.GUS染色结果表明,该序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子功能.     

超声波辅助农杆菌介导的小麦遗传转化初步研究

报道了一种改进的小麦转化方法——超声波辅助的农杆菌转化法。发芽的小麦种子经超声波处理20min后再经农杆菌浸染,浸染后的种子按正常播种和栽培管理至结实,对收获的成熟种子进行卡那霉素抗性筛选。结果表明,受试的4个小麦品种均得到抗性后代,PCR扩增结果证明这些抗性植株是转化植株。GUS染色结果表明不经超声波处理的种子几乎看不到转化的细胞,但经过超声波处理的种子,幼苗基部的细胞转化成功。研究表明,利用超声波辅助的农杆菌转化方法转化小麦能产生可遗传的后代。     

水稻谷蛋白基因GluC启动子的克隆及表达分析

水稻谷蛋白仅在水稻种子胚乳中表达,其启动子是分离胚乳特异性表达启动子的理想材料。本研究克隆了GluC基因启动子pGluC,生物信息学分析表明pGluC内部含有胚乳特异性表达所需要的Skn-1 motif和ACGT-box元件。将pGluC启动子和7个5'端缺失启动子片段构建到pGPTV-GUS载体上,转化水稻愈伤组织,进行组织化学染色和GUS酶活分析。结果表明：全长及截短的-1 911、-1 611、-1 311 bp启动子均能驱动GUS基因在水稻种子胚乳中高效稳定表达。-999、-451、-203、-102 bp启动子失去了胚乳表达特异性,在根、茎或者叶中也检测到GUS表达。该结果为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异高效表达提供了理论依据。     

ZmSTART1调控玉米维管束建成的功能研究

目的 解析玉米基因ZmSTART1的结构;明确ZmSTART1的表达特性;分析ZmSTART1在维管束建成过程中的作用;为玉米抗倒伏和产量性状的遗传改良提供理论基础。 方法 利用生物信息学方法;解析ZmSTART1的结构特征;利用Real-Time PCR技术分析ZmSTART1的时空表达特性;利用ZmSTART1-GFP融合技术转化烟草叶片;对ZmSTART1进行亚细胞定位;构建ZmSTART1过表达载体;利用农杆菌侵染花絮法转化Col-0拟南芥;利用Real-Time PCR技术验证过表达ZmSTART1拟南芥阳性苗;观察过表达ZmSTART1拟南芥的维管束特征;明确ZmSTART1调控维管束建成的生物学功能。 结果 生物信息学分析发现;ZmSTART1是一个仅含有1个START结构域的疏水性蛋白质。Real-Time PCR技术分析ZmSTART1的时空表达特性发现;ZmSTART1在花药、叶片和第一节间中表达量较高。亚细胞定位表明;ZmSTART1定位于细胞质膜上。创制过表达ZmSTART1的拟南芥植株ZmSTART1-OE发现;过表达ZmSTART1-OE转基因拟南芥子叶叶脉和真叶二、三级叶脉个数均比野生型拟南芥多;而且叶脉形成的封闭空间数也显著高于野生型对照;ZmSTART1-OE转基因拟南芥叶片出现四级叶脉时;野生型对照叶片只有三级叶脉。观察茎维管束发育情况发现;野生型拟南芥茎初生结构内维管束为6个;ZmSTART1-OE茎初生结构维管束增多为7个;束间纤维细胞层数减少、番红染色变浅、木质素含量降低。 结论 ZmSTART1属于START家族成员;定位于细胞质膜;在玉米的维管束建成过程中具有重要作用。