Pseudomonas plecoglossicida NyZ12基因无痕敲除方法的建立

旨在建立一种适合环己胺降解菌NyZ12基因无痕敲除的可靠方法。通过overlapping PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pEX18km上,将重组质粒转化到大肠杆菌S17pir中,再通过接合转移到假单胞菌NyZ12菌株内,经pEX18km质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株并通过PCR方法和测序鉴定。结果显示,成功构建了假单胞菌NyZ12菌株orf4637的基因突变株(NyZ12Δ4637)。通过自杀载体同源重组可以成功获得敲除的无痕突变株,且突变株基因组上没有任何抗性筛选标记残留,为环己胺降解菌NyZ12基因功能研究提供了可靠的基因敲除技术。     

副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及应用

目的摸索出一套副溶血性弧菌基因敲除的可靠方案,副溶血性弧菌致病相关基因的敲除对深入研究其致病机制有重要意义。方法通过融合PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pDS132上,将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中,再接合转移到副溶血性弧菌菌株内,经pDS132质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株。结果成功构建了副溶血性弧菌RIMD2210633菌株ΔopaR,ΔtoxR和ΔaphA三个基因突变株。结论通过自杀载体同源重组成功获得精确敲除的无痕突变株更有利于基因功能的研究,使后续副溶血性弧菌突变株与野生株的对比研究成为可能。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 nsdAmgh基因阻断突变株的构建

为研究从玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中克隆到的,与天蓝色链霉菌M 145中的一个重要负调控基因nsd A基因同源的nsdA_(mgh)基因的功能,本文构建了nsd A_(mgh)基因破坏型重组质粒pSRNA2500(pKC1139::1.5 kb nsdA_(mgh)::1.0 kb Km~r),转化ET12567(pUZ8002)获得接合转移供体菌ET12567(pUZ8002,pSRNA2500),通过接合转移将重组质粒导入玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中。在高温和抗生素双重筛选压力下,筛选得到表型为Am~sKm~r的nsd A_(mgh)基因阻断突变株,通过PCR、Dot bloting和Southern blotting验证了突变株中的nsdA_(mgh)基因已被正确阻断。与出发菌株相比,突变株在摇瓶水平上对棉花黄萎病菌的抑制能力提高了一倍。     

海洋来源链霉菌OUCMDZ-3434中wblA基因的功能

【背景】Streptomyces sp. OUCMDZ-3434分离自山东青岛栈桥浒苔样品,其次级代谢产物Wailupemycin类化合物具有良好的α-糖苷酶抑制活性,但产量很低,影响了其进一步研发。【目的】建立海洋来源链霉菌Streptomyces sp. OUCMDZ-3434菌株的遗传转化系统,通过阻断全局性调控基因wblA探究Wailupemycin类化合物产量变化。【方法】以p SET152为载体,采用大肠杆菌-链霉菌属间接合转移策略建立了Streptomycessp.OUCMDZ-3434的遗传转化方法。采用PCR-Targeting策略构建了wblA基因阻断突变株,通过HPLC分析野生型和突变株发酵产物的差异并对表型差异进行显微形态观察。【结果】建立了Streptomyces sp. OUCMDZ-3434遗传转化系统,构建了wblA基因阻断突变株,与野生株相比,突变株发酵产物中Wailupemycin G产量提高了3倍,同时丧失了产生孢子的能力。【结论】在Streptomycessp.OUCMDZ-3434中wblA对Wailupemycin类化合物生物合成起到了负调控作用,同时参与调控孢子形成,本研究为采用遗传改造策略提高Wailupemycin G产量提供了参考。     

台勾霉素生产菌指孢囊菌NRRL 18085遗传操作体系的建立

【目的】建立新型大环内酯类抗生素台勾霉素的生产菌指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum NRRL18085的遗传操作体系,实现台勾霉素相关生物合成基因的敲除突变。【方法】以整合型质粒pSET152为载体,建立了外源DNA通过接合转移进入指孢囊菌NRRL18085的操作方法和培养条件,利用PCR-targeting系统在体外构建了一个台勾霉素卤化酶基因敲除的cosmid质粒,通过接合转移转入到指孢囊菌NRRL18085野生菌中。【结果】获得了台勾霉素卤化酶基因敲除的指孢囊菌NRRL18085的双交换突变株,该突变株失去了产生台勾霉素的能力。【结论】成功建立和优化了指孢囊菌NRRL18085菌株的遗传操作体系,使得在体内分析和鉴定台勾霉素生物合成基因的功能成为可能,同时也为建立其他类似放线菌的遗传操作体系提供了参考。     

杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇中甲基转移酶PieB2的功能

【目的】研究杀粉蝶菌素A1产生菌中甲基转移酶基因pieB2的功能。【方法】利用接合转移和同源重组双交换的方法,构建pieB2基因缺失突变株,以及利用接合转移的方法,构建回补菌株。通过高保真PCR克隆pieB2基因到表达载体pET28a上,构建质粒pJTU5997,转化入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pLysE中诱导表达。利用高效液相色谱检测PieB2的体外酶活。【结果】获得了pieB2基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株不再产生杀粉蝶菌素A1,而是积累了一种脱甲基产物。N-末端融合组氨酸标签的PieB2在大肠杆菌中获得可溶性表达,通过体外催化证明了PieB2甲基转移酶的功能。【结论】体内遗传实验和体外生化实验证明了PieB2作为甲基转移酶在杀粉蝶菌素A1合成中的作用。     

黄脂菌素生物合成基因簇中调控基因xanR3的功能

【目的】研究黄脂菌素产生菌灰黄链霉菌中编码ArsR家族转录调控蛋白(Arsenical resistance regulator)的xanR3基因的功能。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌双亲本接合转移的方法,构建xanR3基因缺失突变株及回补突变株。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR确定黄脂菌素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株中黄脂菌素生物合成基因簇转录水平的检测。【结果】对得到的xanR3基因缺失突变株及回补突变株进行发酵,发现xanR3基因缺失突变株产黄脂菌素能力下降,回补菌株中黄脂菌素产量相比缺失突变株有一定程度的恢复,但仍未达到野生型水平。经鉴定,黄脂菌素生物合成基因簇中共有18个共转录单元,其中4个共转录单元在?xanR3突变株中转录水平明显下降。【结论】ArsR家族转录调控基因xanR3是黄脂菌素生物合成的正调控基因。     

sco1135基因对天蓝色链霉菌M145孢子形成及次级代谢产物合成的调控研究

旨在研究sco1135基因缺失突变对天蓝色链霉菌M145菌株形态及次级代谢的影响。通过PCR-targeting方法获得重组质粒p SJ1135,通过接合转移将其导入天蓝色链霉菌M145,获得sco1135基因缺失突变菌株△sco1135,并以p MS82为载体构建回补菌株△sco1135com,同时以p MS82为空载对照;随后对野生型菌株、突变菌株和回补菌株进行表型分析和抗生素定量观察。结果显示,表型分析及抗生素定量测定发现,在YBP培养基上△sco1135产孢明显延迟于野生型M145,放线紫红素(ACT)产量明显增加,突变株培养基中ACT产量是野生菌株培养基中的2-3倍;转录分析结果表明,48 h时突变株部分与产孢相关基因的转录水平较野生型降低了50%-75%,72 h时突变株部分与产ACT相关基因的转录水平较野生型提高13-20倍。sco1135基因参与调控M145的孢子形成及次级代谢产物ACT的产生。     

金霉素生物合成基因簇中调控基因ctcB的功能

【目的】研究金霉素产生菌中SARP家族转录调控基因ctc B的作用。【方法】利用大肠杆菌、链霉菌的属间接合转移和同源重组双交换的方法,构建ctc B基因缺失突变株。通过c DNA在相邻同转录方向的基因间隔进行PCR验证,确定金霉素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株金霉素生物合成基因簇的转录水平检测。随后,生物信息学预测分析了金霉素生物合成基因簇内Ctc B与DNA的结合位点。【结果】获得了ctc B基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株失去产生金霉素与四环素的能力。金霉素生物合成基因簇内有6个共转录单元,其中4个共转录单元在ctc B基因缺失突变株中转录水平明显下降。软件分析预测到一致性较高的Ctc B结合重复序列。【结论】ctc B正调控金霉素生物合成结构基因ctc G-D、ctc H-K、ctc N-P、ctc W-T 4个转录单元和ctc Q,为进一步研究ctc B调控机制奠定了基础。     

ntrB基因对Agrobacterium sp.ATCC31749合成胞外多糖的调控研究

利用三亲本接合方法将含有ntrB基因两端同源序列的自杀载体pJQ-ntrB-cat导入土壤杆菌(Agrobacterium sp.ATCC 31749)中,获得了ntrB基因突变株.结果表明,ntrB突变株对NH4Cl和KNO3的利用能力有所下降.当分别以谷氨酸和谷氨酰胺为氮源时,ntrB突变株生长状况与野生菌相同.n...     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism