猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合感染性克隆的构建和应用

高致病性猪蓝耳病近年来在我国广泛流行,目前尚无高效疫苗用于该病的防制.本研究以PRRSV弱毒感染性克隆-pAPRRS作为主要骨架,将高致病性猪蓝耳病病毒江西分离株(JX143)的主要结构蛋白基因(ORF4-7)以及3'UTR区域替换入pAPPRS相应编码区域,构建了pSX12(ORF4-7-3'UTR)、p5NX12(ORF5-7-3'UTR)以及p56N12(ORF5-6)三个PRRSV全长嵌合克隆.经DNA转染Marc-145细胞后拯救出嵌合病毒,并对拯救病毒进行了病毒生物学特性的分析;选取拯救病毒v56N12(ORF5-6)和vSX12(ORF4-7-3'UTR)免疫29日龄猪进行免疫原性试验,结果表明,以v56N12免疫后抗体水平相对较低,故免疫原性相对较差;而vSX12病毒免疫后14d血清ELISA抗体达到阳性值(IDEXXELISA值s/p>0.4),免疫后28d中和抗体效价从原来的1:5以下上升到1:15以上,说明vSX12具有良好的免疫原性并可进行免疫监测;免疫后28 d以强毒JX143株攻毒,结果vSX12免疫组未见发病,而未免疫攻毒对照组全部发病并有1头死亡,vSX12免疫猪攻毒后病毒血症持续6d后消失.而对照组攻毒后至少持续13 d,说明vSX12可对高致病性猪蓝耳病提供有效的免疫保护.本研究构建的三个嵌合病毒为开发同时抗经典和变异株PRRSV感染的二价疫苗,以及探寻高致病性猪蓝耳病病毒的毒力因子奠定了基础.     

利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖

本文探讨依靠RNAi技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV) 增殖的干扰作用.筛选到针对编码PRRS病毒核衣壳蛋白的N基因的两处靶序列作为候选片段,在MARC-145细胞上进行基因干扰实验研究.成功观测到由载体表达的小干扰RNA (siRNA)在MARC-145细胞中对PRRS病毒增殖的抑制现象.通过选取不同时间段对病毒进行TCID50检测,以及对CPE出现时间进行观察和免疫荧光技术,得到RNA干扰对PRRS病毒增殖抑制作用的动态数据.证实在真核细胞水平上,RNA干扰机制可以抑制PRRS病毒的增殖.实验结果表明,依靠载体表达的RNA干扰技术将会对今后针对PRRS病毒的新型疫苗开发提供一个新思路.     

利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖

本文探讨依靠RNAi技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的干扰作用。筛选到针对编码PRRS病毒核衣壳蛋白的N基因的两处靶序列作为候选片段,在MARC-145细胞上进行基因干扰实验研究。成功观测到由载体表达的小干扰RNA(siRNA)在MARC-145细胞中对PRRS病毒增殖的抑制现象。通过选取不同时间段对病毒进行TCID50检测,以及对CPE出现时间进行观察和免疫荧光技术,得到RNA干扰对PRRS病毒增殖抑制作用的动态数据。证实在真核细胞水平上,RNA干扰机制可以抑制PRRS病毒的增殖。实验结果表明,依靠载体表达的RNA干扰技术将会对今后针对PRRS病毒的新型疫苗开发提供一个新思路。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒华东地区分离株RT-PCR-RFLP分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是猪的一种重要传染性疾病病原,已给世界养猪业带来了巨大的经济损失.其主要临床表现为妊娠期母猪的早产、流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎,新生仔猪肺炎、生长迟缓.PRRSV为动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员.病毒有囊膜、呈球形,基因组为单股正链RNA,大小约15kb,含有8个开放阅读框(ORF),其中ORF1(包括ORF1a和ORF1b)编码病毒RNA复制酶;ORF2-7分别编码病毒结构蛋白:GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA文库的构建及基因组序列的测定

猪繁殖与呼吸综合征自1987年首次在美国发现以来,几年之内便席卷了北美洲和欧洲大陆,后蔓延至许多亚太国家和地区 .我国1995年首次暴发此病,该病在我国普遍存在,给我国养猪业的健康发展造成巨大障碍.目前国内外尚无理想防疫疫苗.当前用于预防的猪繁殖与呼吸综合征的主要疫苗是弱毒苗和灭活疫苗.灭活疫苗免疫效果差,弱毒苗能提供较好的免疫保护,但毒力返强的几率相当高,这一点已在几年前丹麦等国因广泛使用弱毒苗而导致该病大暴发中得以证实.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA文库的构建及基因组序列的测定

猪繁殖与呼吸综合征自1987年首次在美国发现以来[1],几年之内便席卷了北美洲和欧洲大陆[2],后蔓延至许多亚太国家和地区 [3,4].我国1995年首次暴发此病,该病在我国普遍存在,给我国养猪业的健康发展造成巨大障碍[5].目前国内外尚无理想防疫疫苗.当前用于预防的猪繁殖与呼吸综合征的主要疫苗是弱毒苗和灭活疫苗.灭活疫苗免疫效果差,弱毒苗能提供较好的免疫保护,但毒力返强的几率相当高,这一点已在几年前丹麦等国因广泛使用弱毒苗而导致该病大暴发中得以证实[6].     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重危害养猪业的病原,对PRRSV的分子生物学研究进展进行了综述,主要包括PRRSV的基因组结构、病毒的非结构蛋白和结构蛋白及其功能、致病机理及复制与转录等.     

猪繁殖与呼吸综合症病毒分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合症病毒是引起猪繁殖与呼吸综合症的病原体,本文对PRRSV的基因组结构、病毒的非结构蛋白和结构蛋白的及其功能的分子生物学研究进展做了简要综述.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒实时PCR检测方法的建立

设计合成了一套引物和TaqMan探针,以扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒的核衣壳蛋白基因,通过反应条件的优化,在国内首次建立了快速定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时PCR方法,并用该法检测患病猪的肺脏等样品.结果表明该方法具有较好的特异性和重复性,对PRRSV细胞培养物的检测下限为0.01TCID50,敏感性比常规RT-PCR高100倍;对10份PRRS疑似猪肺脏样品检测5份为阳性,与病毒分离的阳性符合率为100%.该方法具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,在PRRSV的早期检测、预防控制、进出口检疫及基础研究中会起到重要作用.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒实时PCR检测方法的建立

设计合成了一套引物和TaqMan探针,以扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒的核衣壳蛋白基因,通过反应条件的优化,在国内首次建立了快速定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时PCR方法,并用该法检测患病猪的肺脏等样品。结果表明该方法具有较好的特异性和重复性,对PRRSV细胞培养物的检测下限为0.01TCID50,敏感性比常规RT-PCR高100倍;对10份PRRS疑似猪肺脏样品检测5份为阳性,与病毒分离的阳性符合率为100%。该方法具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,在PRRSV的早期检测、预防控制、进出口检疫及基础研究中会起到重要作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)诱发的一种接触性传染病,其症状主要表现为怀孕母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎及成年猪的呼吸道症状。本病自1987年在美国爆发后,给世界养猪业造成巨大损失。近年来,由于其危害性大而引起专家学者的关注,PRRS在分子生物学方面研究者较多。就其病原特性,基因结构,病毒蛋白,分子生物学诊断以及PRRS基因工程疫苗的研究等方面进行论述。     

Identification of a Putative Receptor for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus on Porcine Alveolar Macrophages

To identify the receptor which may determine the macrophage tropism of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), monoclonal antibodies (MAbs) against porcine alveolar macrophages (PAM) were produced. Two MAbs (41D3 and 41D5) which completely blocked PRRSV infection of PAM were further characterized. It was found that they reduce the attachment of PRRSV to PAM and immunoprecipitate a 210-kDa membrane protein from PAM. This protein was detected on the cell membranes of PAM but not of PRRSV-nonpermissive cells. A colocalization was found between the reactive sites of MAb 41D3 and PRRSV on PAM membranes. All PRRSV-infected cells in tissues of experimentally infected pigs reacted with MAb 41D3. Taken together, all these data suggest that the identified 210-kDa membrane protein is a putative receptor for PRRSV on porcine macrophages.     

Phenotypic Characterization of Porcine IFNc-Producing Lymphocytes in Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Vaccinated and Challenged Pigs

Porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS) continues to be one of the most important swine diseases worldwide. Interferon-γ(IFNγ)-mediated type Ⅰ cell-mediated immune response plays an important role in protection from,and clearance of, PRRS virus(PRRSV). Several lymphocyte subsets including T-helper, CTLs, Th/memory cells, and cd T lymphocytes were previously reported to produce IFNc during PRRSV infection. However, the proportion and phenotypic characterization of these IFNγ-secreting lymphocytes have not been explored. In this study, IFNc producted by different lymphocyte subsets was assessed by multi-color flow cytometry after vaccination with PRRSV modified live vaccine(PRRSV-MLV) and challenge with homogeneous or heterogeneous PRRSV. The results showed that T-helper cells were the major IFNγ-secreting cell population after PRRSV-MLV vaccination and PRRSV challenge. Additionally, the proportion of IFNγ producing Th/memory cells and γδ T cells increased after PRRSV challenge. This difference was accounted for an enhanced ability to produce IFNγ in Th/memory cells and an enlarged quantity of γδ T cells. The results presented here could contribute to our understanding of the roles of IFNγ in protective immunity against PRRSV infection and may be useful for assessment of cell-mediated immunity in vaccine tests.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒BJBLZ株序列剖析

预测与分析HP-PRRSV BJBLZ株序列特点,为进一步该毒株的研究做准备.利用分子生物学软件及服务器,对HP-PRRSV BJBLZ株全序列及各结构蛋白的生化特性、溶解性和核定位信号等进行了分析,结果显示HP-PRRSV BJBLZ株至少可划分12个非结构蛋白和6个结构蛋白;同源性比较显示GP3和GP5蛋白变异性高,M和N蛋白保守.GP3、GP5和M蛋白糖基化位点与参考株有变化,GP2、GP4和N蛋白糖基化位点与所有参考株一致.服务器预测显示,N蛋白的碱性氨基酸比例明显高于其他蛋白,总平均亲水值明显低于其他蛋白;GP2、GP3和GP4蛋白不稳定,GP5、M和N蛋白稳定.6个结构蛋白预测不溶性概率均占66％以上,GP3不溶性概率最高.可以利用以上一些不同于以往各代表株的特点,为PRRS的诊断和防治进行进一步的研究.