人IL-6基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建人白细胞介素6(IL-6)的原核表达载体并优化其表达条件,为IL-6的高效表达提供试验依据。以人T细胞cDNA为模板通过PCR方法扩增IL-6基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用Western blotting及人IL-6检测试剂盒分析鉴定。在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、卡那霉素浓度、培养温度等来优化IL-6表达条件。结果显示,原核表达载体pET28 a(+)-IL-6成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约22 kD的IL-6蛋白,经Western blotting鉴定正确,经人IL-6试剂盒检测显示具有较高的免疫活性。在IPTG浓度400μmol/mL,卡那霉素浓度50μg/mL,40℃培养6 h的条件下,目的蛋白表达量最高,可占总蛋白表达量的40%。成功构建人IL-6原核表达载体且获高效表达,为研究IL-6生物学活性及产品开发提供了试验基础。     

猪SsBHMT基因的原核表达及条件优化

甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）是一种甲基代谢酶,催化甜菜碱转甲基到高半胱氨酸生成甲硫氨酸。对含有pET30a-SsBHMT重组质粒的菌株进行诱导表达分析,通过对菌株、IPTG诱导浓度、时间等诱导表达条件进行优化,结果表明：该目的蛋白主要以包涵体的形式出现;经过条件优化,目的蛋白表达量在上清和沉淀中均有所增加,但仍主要以包涵体的形式存在;大肠杆菌菌株ER2566为适合目的蛋白表达的菌株;在37℃,IPTG浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为10 h的条件下,目的蛋白表达量最多。研究结果为进一步蛋白纯化与抗体制备奠定了基础。     

宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化

目的利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件。方法利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL（BLCAP）SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32（a）中,从而构建原核表达重组质粒pET-32（a）-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化回收,并采用SDS—PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28ku的融合蛋白,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建了pET-32（a）-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础。     

原核生物核糖核酸酶HII基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

核糖核酸酶HII (RNaseHII)能有效降解RNA和DNA杂交链中的RNA链。为进一步研究其功能 ,利用大肠杆菌XL1blue为模板 ,相应的寡聚脱氧核苷酸为引物 ,PCR扩增大肠杆菌RNaseHII(rnh 2 )基因 ,并将目的基因连接到克隆载体 pUC18上 ,经测序确认无误 ,分别亚克隆到能够进行IPTG诱导的表达载体pTrcHisC和进行温度诱导的表达载体pBV2 2 0上。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞中获得高效表达。在载体pTrcHisC和 pBV2 2 0中目的蛋白RNaseHII的表达量均超过菌体总蛋白的 2 0 % ,且表达产物以稳定的包涵体形式存在。此项工作为以后目的蛋白的纯化提供了有利条件 ,并为研究其结构和功能奠定了基础。     

基因重组大肠杆菌表达血红素加氧酶-1及培养条件优化

【背景】血红素加氧酶-1 (HO-1)具有抗氧化应激、抗凋亡和抗纤维化等多种生理效应,有望成为一种新型药物应用于临床疾病的治疗。【目的】构建表达HO-1的基因重组大肠杆菌(Escherichiacoli),并优化其表达培养条件,实现HO-1高产率的表达。【方法】PCR法克隆集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803的HO-1基因(ho1),构建重组质粒pET-28a-ho1,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,单因素实验优化表达培养基的种类、诱导剂添加时间、诱导培养时间、诱导剂浓度和诱导培养温度。【结果】构建了表达HO-1的基因重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-ho1菌株,用甘油(GY)培养基培养至菌体浓度OD_(600)约为0.8时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导,30°C诱导培养6 h,HO-1的表达量最高,Ni-NTA柱分离纯化得到的HO-1收率占细胞总蛋白的10.9%。【结论】获得了可溶性表达HO-1的基因重组大肠杆菌及其较佳的培养条件,为进一步研究集胞藻来源的HO-1的酶学性质和应用奠定了基础。     

烟夜蛾几丁质酶基因的克隆与表达

运用RT-PCR技术扩增编码烟夜蛾Helicoverpaassulta(Guen啨e)幼虫几丁质酶基因的cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得该基因的成熟蛋白阅读框序列。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T-2中,并转化入原核细胞中表达,序列测定结果表明,烟夜蛾幼虫几丁质酶基因的成熟蛋白阅读框全长1338bp,编码445个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为50.1kDa和9.26;推导的氨基酸序列与其近缘种棉铃虫几丁质酶氨基酸序列的一致性达99%,与其他6种昆虫几丁质酶的氨基酸序列也高度一致(65%~76%),并具有几丁质酶的典型特征。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上并转化BL21,SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导,76kDa附近没有特异蛋白条带出现,表明烟夜蛾几丁质酶基因不能在原核表达载体pGEX-4T-2中表达。     

木薯MeNINV4基因在原核细胞中的表达及优化

转化酶是植物中蔗糖降解过程的关键酶之一,可催化蔗糖不可逆地分解为葡萄糖和果糖,在植物生长发育、平衡碳水化合物及对逆境胁迫的响应等方面具有重要的作用。本研究利用从木薯中克隆到碱性/中性转化酶MeNINV4基因,将其重组构建到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组载体MeNINV4-pGEX-6p-1,并对其融合蛋白表达的IPTG诱导浓度、起始菌液浓度、诱导温度和诱导时间条件进行优化。研究结果发现:GST-MeNINV4融合蛋白的表达量在一定范围内随着IPTG诱导浓度、起始菌液浓度和IPTG添加时间的增加而增加。重组菌在OD_(600)为1.0左右,IPTG浓度为0.6 mmol/L,在37℃条件下诱导5 h后,重组蛋白的表达量达到最大值。本研究通过诱导目的蛋白在原核细胞中的表达并且优化表达条件,使目的蛋白在原核细胞中的表达量显著增加,为进一步研究目的蛋白的结构、功能及酶学特性等生物学功能提供理论依据。     

金钗石斛过氧化物酶基因的克隆及原核表达

为了获得金钗石斛(Dendrobium nobile)过氧化物酶基因(命名为DnPOD)编码序列,分析该基因的分子特征,掌握该基因原核表达数据,本研究采用同源克隆的方法,以金钗石斛cDNA为模板,设计基因特异性引物克隆DnPOD基因,分析了DnPOD基因结构,将重组质粒pET28α-DnPOD在BL21 (DE3)菌株...     

毛白杨细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及表达分析

利用同源克隆技术得到1个毛白杨细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因,命名为PcAPX。该基因编码249个氨基酸残基,预测分子量为33.01kD。采用原核表达技术在大肠杆菌中表达并纯化该蛋白并进行酶活性分析,结果表明:重组PcAPX蛋白对抗坏血酸(AsA)和过氧化氢(H2O2)有很高的活性,其对抗坏血酸的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)分别为(0.71±0.03)mmol·L-1和(0.41±0.02)mmol·L-1·min-1·mg-1;对过氧化氢的Km和Vmax分别为(0.60±0.21)mmol·L-1和(0.35±0.12)mmol·L-1·min-1·mg-1,表明PcAPX对AsA和H2O2拥有较高的催化底物的能力和催化效率。利用实时定量RT-PCR分析毛白杨PcAPX基因的表达模式,结果表明其在老叶中表达量高于新叶、韧皮部、形成层和根部。该研究结果将进一步促进毛白杨APX基因家族成员参与植物生长调控的研究。     

一种几丁质酶基因的克隆表达及酶解产物分析

【目的】克隆耐冷菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)的几丁质酶基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其酶解产物。【方法】采用PCR扩增法从Pseudoalteromonas sp.DL-6中克隆几丁质酶基因(chi A),连接到表达载体p ET28a,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测几丁质酶Chi A的分子量与纯度,4-甲基伞形酮荧光底物4MU-(Glc NAc)2测定酶活,电喷雾质谱(ESI-MS)检测酶解产物。【结果】chi A基因(Gen Bank登录号KF234015)在大肠杆菌中高效表达,Ni-NTA亲和层析柱纯化几丁质酶Chi A的总活力可达168.68 U。ESI-MS检测结果表明重组蛋白酶解1%胶体几丁质的产物为几丁寡糖。【结论】利用内切几丁质酶Chi A水解几丁质生产几丁寡糖,为其在食品、医药和农业等领域的潜在应用提供有利参考。     

丹参病程相关蛋白基因PR10的克隆与表达分析

病程相关蛋白(PR)的产生与积累是植物体应对生物或非生物胁迫的主要特征之一。该研究以人工培养的丹参幼苗为材料,通过分析丹参转录组数据,根据丹参病程相关蛋白基因PR10的序列设计特异性引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从丹参中获得PR10基因的开放阅读框(ORF),命名为SmPR10-1(GenBank注册号KF877034),并进行原核表达和纯化。结果表明:(1)SmPR10-1基因ORF为477bp,编码158个氨基酸,其蛋白质分子质量为17.38kD。(2)通过蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等生物信息学分析,发现SmPR10-1基因具有保守序列(G-X-G-G-X-G)和(K-A-X-E-X-Y),其编码蛋白与葡萄等双子叶植物中的PR10蛋白同源性较高。(3)经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,含有表达载体pET32a-SmPR10-1的大肠杆菌(Escherichia coli BL21)可诱导表达融合蛋白;对影响蛋白表达的4个因素优化结果表明,SmPR10-1蛋白的最佳表达条件为:IPTG终浓度0.4mmol/L、起始宿主菌密度A600为0.8、诱导温度30℃、诱导时间8h,并得到纯化的SmPR10-1蛋白。该结果为进一步研究SmPR10-1基因在丹参抗病方面的生物学功能和培育丹参抗病品种奠定了基础。     

苯甘氨酸氨基转移酶基因hpgt的原核优化表达与酶动力学特性研究

苯甘氨酸氨基转移酶(4-Hydroxyphenylglycine aminotransferase)是假单胞菌所产生的一种能够合成D-苯甘氨酸的重要转氨酶。利用密码子优化技术,合成苯甘氨酸转移酶基因。构建原核重组质粒pCDF-hpgt,转入感受态细胞E.coli BL21(DE3),优化表达His-HpgT蛋白。利用Ni-NTA柱纯化技术获得高纯度的His-HpgT融合蛋白。分别测定融合蛋白在正反向反应中的酶活力单位及最佳的反应温度、pH值及其他动力学参数,并对该酶特性作相关的机理分析。测定结果表明,正向反应和反向反应的酶比活力分别为749mU/mg、2 257mU/mg,此酶分解苯甘氨酸的能力要强于合成苯甘氨酸;正向反应的最适温度与pH分别是35℃和8.0;由米氏方程得出该酶对苯甘氨酸的亲和力远大于谷氨酸;较低浓度的苯乙醛酸即可抑制反应的进行。     

密码子优化的肺炎支原体P1蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

目的:获得密码子优化的肺炎支原体P1黏附蛋白优势表位抗原基因,并在大肠杆菌中表达,为临床诊断试剂和疫苗研制打下基础。方法:采用生物信息学分析肺炎支原体P1蛋白的抗原表位,筛选特异性P1蛋白优势表位区;采用大肠杆菌优势密码子,设计上述P1蛋白优势表位基因序列;采用退火PCR技术合成上述基因,并利用载体pGEX-4T-2实现P1优势表位抗原在大肠杆菌中的表达;采用ELISA法对纯化的P1抗原活性进行测定。结果:肺炎支原体P1蛋白特异性抗原表位主要位于1154~1521 aa,获得的P1优化密码子基因平行突变37个稀有密码子和2个终止密码子;在大肠杆菌中表达的GST-P1融合蛋白的相对分子质量为65.9×103,纯化后重组抗原能与肺炎支原体感染者血清发生特异性的免疫反应。结论:采用密码子优化基因合成技术实现了肺炎支原体P1优势表位抗原在大肠杆菌中的高效表达,为肺炎支原体感染的诊断试剂研究提供了重要参考。     

家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

甘油脱水酶gldC基因克隆、表达与鉴定

目的：表达及纯化甘油脱水酶γ亚基蛋白。方法：使用PCR及DNA重组技术,将甘油脱水酶7亚基基因gldC重组到含麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白表达载体pMAL—c2x中,在大肠杆菌中进行表达。结果：转化重组质粒pMAL/gldC的大肠杆菌经IPTG诱导,SDS—PAGE分析显示表达出的MBP—gldC融合蛋白相对分子质量约66kD,与预期大小一致,并经Western blot分析证实。用直链淀粉树脂亲和层析纯化得到电泳均一的融合蛋白。结论：成功地获得甘油脱水酶γ亚基融合蛋白,以便进一步研究其生物学性能。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

高山离子芥CbMAPK3基因克隆与原核表达

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在信号传导过程中发挥着重要的作用。以高山离子芥叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到全长CbMAPK3基因cDNA,将其与大肠杆菌表达载体pET-30a连接,构建原核表达载体pET-30a-CbMAPK3,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blot检测结果表明该基因表达了1个约46kD的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了实验基础。     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株单加氧酶基因的克隆与表达

构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株荧光素样单加氧酶基因表达克隆载体,并进行融合表达。PCR扩增出嗜麦芽寡养单胞菌D2菌株基因组DNA中包含单加氧酶基因约1300bp的核酸片段,将其克隆到T载体pMD-18中进行序列测定,所得序列申请并获得GenBank登记号(GQ122330)。DNA star软件分析发现该基因片段中含有一个996bp的完整开放读码框架(ORF),与GenBank中收录的S.maltophilia R551-3(CP001111/GenomeProject17107)和K279a(AM743169)的MO基因核酸序列同源性分别为90%和89%,氨基酸序列同源性分别为93%和90%。根据该ORF序列设计分别含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的表达克隆扩增引物,PCR扩增、双酶切后将产物亚克隆到pET32a载体中,经过双酶切验证,证实成功获得了表达重组载体pET32a/MO;将其转化宿主菌E.coli BL21,IPTG诱导后成功表达出54.2ku的MO融合蛋白,为该酶进一步的功能研究和开发奠定了基础。