食蟹猴腹腔注射低剂量百草枯致胰腺α-突触核蛋白的病理变化

本研究旨在通过食蟹猴经腹腔注射低剂量百草枯来探讨胰腺α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)的病理变化。由广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司提供的12只(8~10岁)健康雄性食蟹猴为实验动物,随机分为实验组A、B和正常对照组C,每组4只,实验组分别于给药百草枯(paraquat,PQ)5个月,2个月后安乐死(对照组每阶段2只)。利用免疫组织化学方法和免疫蛋白印记方法检测各组食蟹猴胰岛α-syn的表达特点和表达量。结果显示,α-syn免疫活性物质主要见于胰岛细胞胞浆,并且α-syn在各组食蟹猴胰岛存在差异表达,其中给药百草枯5个月后的食蟹猴胰岛α-syn表达量最高,对照组表达量最低。我们的研究表明食蟹猴腹腔注射低剂量百草枯可致胰岛α-syn表达上调,百草枯是造成胰岛腺α-syn差异表达的关键因素之一,其结论将为相关疾病的模型制作、早期诊断及干预提供新的思路。     

长期十二指肠炎症对帕金森病致病蛋白pSer129-α-syn沉积的影响

目的 探究慢性十二指肠炎症对帕金森病致病蛋白pSer129-α-syn(磷酸化的α突触核蛋白)积累的影响,为帕金森病的机制研究提供新的思路。方法 利用给予野生型雄性Wistar大鼠口饲半胱氨酸盐酸盐的方法建立慢性十二指肠溃疡模型,利用十二指肠石蜡切片HE染色法评估十二指肠绒毛状态及炎性细胞浸润情况;利用十二指肠石蜡切片免疫组化法评价十二指肠局部致病蛋白pSer129-α-syn的聚集情况;采用脑部矢状切石蜡切片免疫组化法探讨脑部海马区致病蛋白pSer129-α-syn的聚集情况。结果 长期慢性十二指肠溃疡能导致致病蛋白pSer129-α-syn在十二指肠局部少量聚集,也可以引起脑部致病蛋白pSer129-α-syn的积累。结论 长期慢性十二指肠溃疡可以增加帕金森病的致病蛋白pSer129-α-syn在肠道及大脑中的积累。     

含CpG基元核酸疫苗免疫慢性MPTP帕金森病小鼠的治疗作用

目的探讨含有CpG基元的α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）核酸疫苗免疫慢性帕金森病小鼠的治疗效果。方法将本实验室成功构建的含有CpG基元的α-syn核酸疫苗-pVAX1-hα-Syn140用Qiagen试剂盒大量制备α-syn质粒;24只慢性MPTP帕金森病小鼠随机分为3组：实验组、空质粒对照组和PBS对照组,各组小鼠分别肌注pVAX1-hα-Syn140重组质粒、pVAX1空质粒和PBS各100μL,共免疫3次,每次间隔3周,末次免疫后2周,观察小鼠行为学变化及中脑黑质α-syn表达和多巴胺能神经元数目变化。结果pVAX1-hα-Syn140核酸疫苗免疫组小鼠的类帕金森病样症状与pVAX1空质粒和PBS对照组相比减轻,有显著差异（P〈0．01）;小鼠中脑黑质α-syn表达较对照组减少约39％（P〈0．01）,且多巴胺能神经元数目较空质粒和PBS对照组增多了46％～55％（P〈0．01）。结论pVAX1-hα-Syn140核酸疫苗具有较强的免疫原性,能对帕金森病小鼠产生较好的免疫治疗作用。     

蛋白质/多肽片段互补分析法检测alpha-突触核蛋白在细胞中的聚集

Alpha-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）聚集是引起帕金森病（Parkinson’s disease, PD）发生发展主要原因。本文用蛋白质/多肽片段互补分析法（protein-fragment complementation assays, PCAs）检测α-syn在细胞内的聚集。分别构建融合α-syn与人工改造的荧光素酶human Gaussiaprinceps luciferase（hGLuc）蛋白N端或C端蛋白的质粒,共转入人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,通过检测酶活性来确定野生型（wild type,WT）及A53T突变体α-syn在细胞中的聚集情况。结果表明WT和A53T突变α-syn都能使荧光素酶活性增强,而且与野生型α-syn相比,突变体A53T的荧光素酶活性更强,说明二者都能聚集,而且A53T聚集程度高于WT。PCAs法具有高灵敏度,不仅能检测α-syn在细胞内的聚集,而且能反映其聚集的程度,为研究帕金森病提供了研究思路和相应药物筛选的有效工具。     

血清pro-BDNF、α-syn、RANTES水平在不同H-Y分期帕金森病患者中的变化及与认知功能障碍的关系

摘要 目的：探讨血清脑源性神经营养因子前体蛋白（pro-BDNF）、α-突触核蛋白（α-syn）、活化T细胞趋化因子（RANTES）水平在不同Hoehn-Yahr（H-Y）分期帕金森病（PD）患者中的变化及与认知功能障碍的关系。方法：选取2019年11月～2021年11月成都市第三人民医院收治的92例PD患者,将其按照H-Y分期的差异分作早期组（H-Y分期1～2期）45例以及中晚期组（H-Y分期3～5期）47例,另取我院同期50例健康体检志愿者作为对照组。比较各组血清pro-BDNF、α-syn、RANTES水平,以Spearman相关性分析血清pro-BDNF、α-syn、RANTES水平与PD患者H-Y分期的相关性。采用蒙特利尔认知评估量表（MoCA）评估认知功能,并据此将所有患者分为认知功能障碍组和无认知功能障碍组,以单因素及多因素Logistic回归分析PD患者认知功能障碍的影响因素。结果：早期组和中晚期组的血清pro-BDNF、α-syn、RANTES水平均高于对照组,且中晚期组上述各项指标水平高于早期组（P＜0.05）。Spearman相关性分析结果显示,血清pro-BDNF、α-syn、RANTES水平均与PD患者H-Y分期呈正相关（P＜0.05）。单因素分析结果显示,PD患者是否发生认知功能障碍与其年龄、病程、受教育年限以及血清pro-BDNF、α-syn、RANTES水平有关（P＜0.05）。进一步多因素Logistic回归分析结果显示,年龄偏大、病程较长以及血清pro-BDNF、α-syn、RANTES水平升高均是PD患者认知功能障碍的危险因素,而受教育年限较长是认知功能障碍的保护因素（P＜0.05）。结论：血清pro-BDNF、α-syn、RANTES水平在PD患者中异常升高,且与H-Y分期呈正相关,还与患者认知功能障碍密切相关。     

血清α-syn、Aβ1-42、SSA在帕金森病患者中的表达及与认知功能损害的关系

摘要 目的：探讨血清α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）、β淀粉样蛋白1-42（β-amyloid 1-42,Aβ_1-42）、淀粉样蛋白A（serum amyloid A,SSA）在帕金森病患者中的表达及与认知功能损害的关系。方法：收集本院2018年7月~2020年11月收治的136例帕金森病患者为病例组,依据Hoehn-Yahr（H-Y）分级分为早期组（n=76）与中晚期组（n=60）;依据蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment Scale,MoCA）分为认知功能正常组（n=94）与认知功能损害组（n=42）。另选同期本院体检正常者105例纳入对照组。对比各组血清α-syn、SSA、Aβ_1-42水平及MoCA,并用Pearson相关系数分析病例组患者血清α-syn、SSA、Aβ_1-42水平与MoCA的相关性,用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析血清α-syn、SSA、Aβ_1-42水平对帕金森病和认知功能损害的诊断价值。结果：病例组血清α-syn、SSA水平高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;病例组Aβ_1-42、MoCA评分低于对照组（P<0.05）。病例组晚期患者血清α-syn、SSA水平高于早期患者（P<0.05）;病例组晚期患者Aβ_1-42、MoCA评分低于早期患者,差异有统计学意义（P<0.05）。病例组有认知功能损害患者血清α-syn、SSA水平高于认知功能正常患者（P<0.05）;病例组有认知功能损害患者Aβ_1-42、MoCA评分低于认知功能正常患者（P<0.05）。病例组患者血清α-syn、SSA与MoCA均呈正相关（P<0.05）,Aβ1-42与MoCA呈正相关（P<0.05）。血清α-syn、SSA、Aβ_1-42水平对帕金森病诊断的曲线下面积分别为0.858、0.821、0.785;血清α-syn、SSA、Aβ_1-42水平对帕金森病认知功能损害预测的曲线下面积分别为0.877、0.825、0.783。结论：帕金森病患者血清α-syn、SSA、Aβ_1-42水平较健康者变化明显,且可能和帕金森病的诊断、病情进展和认知功能损害有一定关系。     

α-突触核蛋白对线粒体膜造成孔道样损伤

α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn）作为第一个发现的帕金森病（Parkinson’s disease, PD）致病基因,在PD发生发展过程中具有重要作用。尽管有研究发现,α-syn对线粒体功能有损伤作用,但其对线粒体膜的损害机制尚不明确。本实验旨在探究α-syn对线粒体膜形态的影响,并找到更加微观的方式观察线粒体膜的变化。Thy-1-α-syn转基因动物与野生型动物相比,线粒体膜电势降低17%（P<0.01）,膜通透性增加20.5%（P<0.01）,转基因组线粒体细胞色素C释放增多64%（P＜0.01),这有可能引起线粒体自噬和细胞凋亡。原子力显微镜结果显示,野生型小鼠脑组织线粒体表面光滑,α-syn转基因小鼠脑组织线粒体表面发现有锯齿状改变,而且在过表达α-syn的原代神经元线粒体膜表面有许多小凹陷,出现口径60 ～ 200 nm,深达20 ～ 60 nm的孔道。这可能是α-syn对线粒体膜造成的孔道样损伤。过表达α-syn全长组和N端组的原代神经元电镜结果显示,线粒体膜被破坏,并且出现空泡样线粒体和自噬小泡。本研究发现,过表达α-syn可能在线粒体表面形成孔道样改变,α-syn的N端是引起线粒体膜损伤主要结构域。     

原子力显微镜检测过表达α-突触核蛋白引起的线粒体结构变化

目的：利用原子力显微镜等方法,明确α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）过表达对线粒体的影响。方法：将腺相关病毒（AAV）载体介导表达的α-syn (AAV /α-syn)病毒包装颗粒,给大鼠脑内黑质区定位注射,建立α-syn过表达的大鼠模型,并以AAV介导表达的报告基因LacZ (AAV/LacZ)为动物对照组。提取大鼠黑质脑组织的线粒体,并通过JC1染色检测线粒体膜电势（ΔΨ）变化和Western Blot检测线粒体中α-syn蛋白量的变化;采用原子力显微镜观测线粒体表面结构的变化。结果：实验组大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因,第16周时,Western blot显示线粒体中α-syn蛋白量增加约2倍;JC1染色发现ΔΨ下降;原子力显微镜观测可见线粒体体积增大,线粒体膜表面出现较多孔道样改变。结论：大鼠黑质脑组织过表达α-syn基因,第16周时,可导致α-syn蛋白在线粒体积聚;并可引起线粒体增大、膜形成孔道样改变、ΔΨ下降。     

外周炎症促发帕金森病的神经机制研究进展

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是发病率排名第二位的中枢神经系统退行性疾病,其病理特点是黑质致密部多巴胺能神经元丢失。对PD患者的尸检分析和实验动物研究显示小胶质细胞激活和炎症因子水平的升高是PD脑组织的共同特征。同时研究显示PD患者病变脑区及毗邻区域检测到来自周围的免疫细胞的浸润和积聚。本文对外周炎症跨血脑屏障(bloodbrain barrier, BBB)、错误折叠的α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)引发小胶质细胞激活和PD脑内炎症等方面进行总结,为延缓PD发病提供潜在治疗措施。     

以Cα-Cα距离为基础的构象空间的可视化研究

蛋白质结构构象呈现明显的规律,研究其在特定构象空间的分布对蛋白质结构预测和模拟具有重要意义.本文以449个非冗余的高分辨率蛋白质结构为材料,以Cα-Cα距离向量代表蛋白质片段.然后利用主成分分析方法,建立蛋白质片段构象空间的可视化构图,并且单个蛋白质分子可以映射到该空间形成一个顺序连接的路径.从而,可以很直观的分析各长度片段(4～9个残基的片段)的分布情况及其内在的连接关系.图形显示了明显的聚集性,以及各种类型片段与二级结构明显的对应关系.     

四环素调控A30P突变α-synuclein转基因小鼠的构建

为了构建四环素调控的人A30P突变α-synuclein转基因小鼠模型,将外源基因pTRE2-syn和pBC-rtTA同时显微注射到FVB小鼠(Mus muscculus)受精卵的雄原核中,将注射后存活的受精卵移植到同期发情的假孕受体鼠输卵管中,出生个体经PCR检测,获得rtTA和A30P突变α-synuclein双阳性转基因雌鼠1只,A30P单基因阳性雄鼠13只并传代.强力霉索诱导后双阳性后代脑区各部分A30P突变α-synucleinmRNA均有表达,而在诱导满4周后,脑干α-synuclein蛋白表达明显增加,8周后增加更明显.结果表明,通过强力霉素诱导后,可在小鼠小脑、脑干、海马、皮层检测到A30P mRNA表达,脑干α-synuclein表达量显著增加.     

运用染色质免疫沉淀技术筛选出AP-2α的靶基因GALK1

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域.与其他方法相比,染色质免疫沉淀技术 (chromatin immunoprecipitation assay, ChIP ) 是一种近来研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的最好方法之一.本研究利用 ChIP 克隆方法, 找出了 AP-2α所调控的新的下游靶基因 GALK1,并应用 Luciferase assay和 RT-PCR 实验进行了初步的验证.这一新发现,有利于我们进一步研究转录因子AP-2α的功能.     

基于图论模型的蛋白质结构类型的研究

提出了基于图论模型的H系数分类蛋白质结构为H结型和NH结型的方法.论述了蛋白质结构中序列不相邻的C_α原子之间的空间距离与序列相邻的C_α原子之间空间距离的关系.用此方法对PDB的66个单链蛋白质结构进行分类,结果显示H结型占18.2%.H结在全α型中出现比例较高,在全β型中出现比例较小,所以H结倾向出现在含有α螺旋的蛋白质结构中.     

α-Synuclein在脑缺血中的作用

α-Syn(α-Synuclein,SNAC)最初是从阿尔茨海默病患者大脑的淀粉样斑块中分离出来的一种蛋白质,在突触活动中扮演着重要的角色.α-Syn主要在脑中表达,研究发现其参与脑缺血损伤发生发展.在现有证据的基础上,该文简要介绍α-Syn的基本概念,并介绍α-Syn在脑缺血后的表达变化,重点探讨α-Syn在脑缺血中...     

siRNA沉默HIF-1α对胎肝基质细胞SDF-1α表达的影响

为了研究低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1alpha,HIF-1α)在干细胞增殖分化过程中的作用机制,构建了2个HIF-1α慢病毒siRNA干涉载体,并转染人胎儿肝脏基质细胞(fetal liver stromal cell,FLSC).根据绿色荧光蛋白的表达评估转染效率后进行流式细胞分选,获得高表达慢病毒干涉载体的细胞.实时荧光定量PCR和蛋白质印迹检测了转染细胞中HIF-1α基因的干涉效率,结果显示,与对照组相比,常氧下培养的细胞HIF-1α基因表达量仅为其相对表达量的18.8%和25.5%,干涉效率分别为81.2%和74.5%,低氧处理后的细胞HIF-1α相对表达量分别为对照组的21.2%和29.3%,干涉效率分别为78.8%和70.7%,均具有显著差异.蛋白质印迹结果显示,在蛋白质水平表达也明显受抑制,且重组干涉质粒pSicoR-HIF-1α1的干涉效应较强.RT-PCR、免疫荧光和ELISA法检测了沉默HIF-1α后胎肝基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)在RNA和蛋白质水平的表达变化,干涉后细胞SDF-1α的表达明显减低.低氧条件下SDF-1α基因的调控作用有可能是通过低氧激活HIF-1α而诱导产生的,HIF-1α在干细胞增殖分化的分子调控机制中具重要作用.     

二氢杨梅素经激活AMPK/ULK1通路改善2型糖尿病大鼠帕金森病样病变

本文旨在探究二氢杨梅素(dihydromyricetin, DHM)对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠帕金森病(Parkinson’s disease,PD)样病变的作用及机制。喂养SpragueDawley(SD)大鼠高脂饲料和腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)建立T2DM模型,用DHM (每天125或250 mg/kg灌胃)处理24周,用平衡木实验检测大鼠运动能力,用免疫组织化学法检测大鼠中脑多巴胺能(dopaminergic, DA)神经元细胞变化和自噬启动相关蛋白ULK1的表达,用Western blot检测大鼠中脑α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)蛋白表达和AMPK活化水平。结果显示,与正常对照组相比,长期患T2DM的大鼠出现运动功能障碍,中脑α-syn聚集增加,TH蛋白表达水平下调,DA能神经元数目减少,AMPK活化水平降低,ULK1表达水平显著下调,24周DHM (每天250 mg/kg)处理明显改善T2DM大鼠上述PD样...     

PIAS3α过表达对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究过表达PIAS3α蛋白对人前列腺癌细胞系DU145细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法 构建pcDNA3.1(+)-HA-PIAS3α真核表达载体,转染前列腺癌细胞系DU145,以蛋白免疫印迹实验检测外源PIAS3α的表达,通过MTT法检测细胞增殖,以流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡.结果 成功构建PIAS3α真核表达质粒,蛋白免疫印迹实验证实外源性PIAS3蛋白质DU145细胞中获得表达.分析目的 蛋白质过表达后的细胞生物学效应,结果显示在DU145细胞中过表达PIAS3α后,细胞增殖受到抑制;同时,细胞周期G0/G1期细胞显著增加,而S期细胞减少,细胞凋亡比率增加.结论 过表达PIAS3α抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡.     

HIF-1α选择剪接异构体的结构及其功能

选择剪接是"一个基因-mRNA组-蛋白质组"的新概念,由一个基因产生的多种结构相似的蛋白质家族成员的内在联系是后基因组学的重要内容.缺氧诱导因子1(HIF-1)是诱导与缺氧应激反应有关的基因表达最有效的转录因子,是缺氧信号转导的整合平台.HIF-1α是HIF-1功能调节的核心.目前多种HIF-1α选择剪接异构体被克隆,它们对HIF-1α功能的竞争性抑制作用是大多数HIF-1α选择剪接异构体的主要特点,提示了一种HIF-1活性的新的调控机制, 也为缺氧信号转导和基因表达调控研究提供了新的线索.     

水稻白叶枯病抗性基因Xα21和稻瘟病抗性基因Pi-d2激酶蛋白质在毕赤酵母中的表达及条件优化

[目的]白叶枯病和稻瘟病是最主要的水稻病害,Xα21是水稻白叶枯病抗性基因,Pi-d2是稻瘟病抗性基因,二者都编码类受体激酶蛋白质.本研究旨在毕赤酵母系统中表达XA21和PI-D2激酶蛋白质.[方法]用Xα21和Pi-d2的激酶区PCR产物,构建了pPICZαA-Xα21K、pPICZαA-Pi-d2K重组质粒,酶切及测序验证后,将重组质粒线性化,转化到毕赤酵母菌株中,系统地比较了不同酵母菌株(KM71、GS115、X33),不同甲醇浓度(1%、2%、3%),不同pH(pH5、pH6、pH7、pH8)值,不同诱导时间(24 h、48 h、72 h)条件下激酶蛋白质的表达情况.[结果]XA21和PI-D2激酶蛋白质可以在毕赤酵母中表达,但表达的蛋白质不能分泌到培养基上清中,而只能在菌体中检测到,对表达条件的系统比较发现,毕赤酵母菌株KM71和X33、2%的甲醇诱导浓度、pH5和48 h以上的诱导时间有利于激酶蛋白质的表达,最后我们在酵母裂解物上清中获得了纯化的考染可见的激酶蛋白质.[结论]在毕赤酵母中表达了XA21和PI-D2激酶蛋白质,为下一步生化特性研究奠定了基础.     

促进或抑制α-synuclein蛋白异常聚集的相互作用蛋白质

α-synuclein蛋白的异常聚集在共核蛋白病的发病过程中起到了关键性作用。与α-synuclein相互作用的蛋白质对其异常聚集起着不同的调节作用,有的蛋白质(如:蛋白synphilin-1、微管蛋白、A-β肽等)会促进α-synuclein蛋白的异常聚集,而另外一些蛋白质(如:膜联蛋白A5、基于自识别元素设计的小肽等)却能够抑制α-synuclein蛋白的异常聚集。认识与α-synuclein相互作用的蛋白,并研究其作用位点,是从分子水平上理解α-synuclein蛋白质异常聚集、揭示共核蛋白病致病机制,以及设计新药物的基础。分子动力学模拟为开展这方面研究开辟了新的途径。文章对该领域的研究进展进行了综述。