丝孢菌Monodictys asperospera (Cooke & Massee) Ellis漆酶的分离纯化及其酶学性质

本研究首次发现Monodictyx asperospera(Cooke&Massee)Ellis具有较好的产漆酶能力.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE-纤维素层析及丙烯葡聚糖凝胶S-300层析纯化,纯化倍数为8.1,回收率为5.7%.漆酶分子量约为77kD,最适反应温度为55℃,最适反应pH6.0,以丁香醛连氮为底物时Km为0.163mm0l/L,Vmax为0.194 mmol(L·min),含糖量为18.14%,Cu2+对漆酶有明显抑制作用.     

白灵侧耳漆酶分离纯化及其酶学性质研究

为了探索白灵侧耳Pleurotus eryngii var.tuoliensis漆酶性质,以白灵侧耳菌株00485为试验材料,从发酵液中分离纯化得到胞外漆酶并对其酶学性质进行测定。纯化流程依次为DEAE-Cellulose阴离子交换层析,CM-Cellulose阳离子交换层析,SP-Sepharose强阳离子交换层析以及Superdex 75凝胶过滤层析,获得胞外白灵侧耳漆酶(Pn Lac)。SDS-PAGE检测结果表明Pn Lac为65k Da的单一蛋白。Pn Lac经过胰蛋白酶水解得到3种肽段,经过NBCI-BLAST后发现它们与糙皮侧耳、环柄韧伞、刺芹侧耳等的漆酶具有同源性。底物为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)时该种漆酶的最适反应温度和p H分别为50℃和3.0,Ca2+和Hg2+能够抑制它的活性,相反地Cu2+和Mn2+能够提高它的活性,米氏常数Km和Vmax分别是0.17mmol/L和1.76OD/min/U。     

猴头菌和金针菇漆酶对不同染料的降解

利用漆酶(laccase)处理染料废水是近年来研究的热点.本研究以猴头菌Hericium erinaceus和金针菇Flammulina filiformis的发酵液为试验材料,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和超滤等方法,对发酵液中的漆酶进行了初步的分离纯化,然后分别研究了两种初提纯漆酶及其与小分子介体组成的漆酶介体系统...     

固定化真菌漆酶降解氯苯嘧啶醇农药

在葡萄糖培养基中,栓菌420(Trametes sp.420)经6mmol/L邻甲苯胺诱导,漆酶活力达到4535U/L(愈创木酚法)。用弱阴离子交换层析可分离得到纯化漆酶。以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂对漆酶进行固定化,30g壳聚糖与30U漆酶混合,酶活回收率高达69%。在酸性条件下,固定化漆酶对农药氯苯嘧啶醇具有良好的降解作用。     

培养条件对毛栓菌漆酶分泌的影响

研究了碳源、氮源、愈创木酚、香兰素及培养条件对漆酶分泌的影响;结果表明,麦草粉作碳源、(NH_4)_2SO_4作氮源有利于漆酶的分泌,适宜浓度的愈创木酚和香兰素等对漆酶的产生有一定的作用;pH在3.0～8.0的范围内对漆酶的分泌影响差别不大,培养温度、接种量、通气量对漆酶的分泌有较大影响。     

毛木耳漆酶纯化及其部分漆酶特性的研究

对毛木耳AuriculariapolytrichaAP4的粗酶液进行PAGE电泳后发现含有三种漆酶同工酶,并且通过运用NativeSDS-PAGE获得三种漆酶的分子量大小分别约为:LacA(110kD);LacB(84kD);LacC(65kD)。对漆酶粗酶液通过硫酸铵分级沉淀和离子交换柱层析进行纯化,用SDS-PAGE证明获得纯化的单一漆酶LacB。LacB漆酶的反应的最适温度为30℃,最适pH为3.0。此酶氧化ABTS的Km值为6.64×10-mmol/L,金属离子对酶活的影响很大,其中5Ca2+,Mg2+,Zn2+,Na2+,Ag2+对漆酶LacB有明显的激活作用;Co2+,Hg2+,Fe3+,Fe2+,Ba2+等对酶活有明显的抑制作用。LacB和其它真菌漆酶一样具有底物专一性不强的特点,并且LacB对RB亮兰染料有很好的脱色作用。     

毛栓菌漆酶诱导及部分特性研究

研究了碳源、氮源、愈创木酚、香兰素及培养条件对漆酶分泌的影响 ;结果表明 ,麦草粉作碳源、(NH4 ) 2 SO4 作氮源有利于漆酶的分泌 ,适宜浓度的愈创木酚和香兰素等对漆酶的产生有一定的作用 ;pH在 3 0 - 8 0的范围内对漆酶的分泌影响差别不大 ,培养温度、接种量、通气量对漆酶的分泌有较大影响。漆酶最适pH值为 4 0 ,最适反应温度为 30℃ ,K+ 、Zn2 + 、Cu2 + 离子可激活漆酶 ;而Ag+ 、Fe3+ 、Cl- 离子可抑制漆酶活性。漆酶的Km值为 1 81× 10 - 3mol L。     

毛栓菌胞外漆酶的纯化及部分性质研究

毛栓菌胞外漆酶经盐析、透析、sephadexG75和G2 5四步纯化 ,粗酶液被纯化了 39 1倍 ,比活力 12 152 ,回收率 4 5 3%。漆酶最适pH值为 4 0 ,最适反应温度为 30℃。K Cu 2 、Zn2 离子可激活漆酶 ,而Ag 、Fe3 离子可抑制漆酶的活性。漆酶的Km值为 1 81× 10 3mol/L。     

杂色云芝组成型漆酶Ⅰ的纯化和底物专一性

采用合成培养基培养杂色云芝As5 4 8,从发酵液中纯化出一种组成型漆酶同功酶Ⅰ .经超滤浓缩 ,DEAE SephadexA 5 0离子交换层析 ,Bio gelP 10 0凝胶过滤纯化了该酶 .SDS PAGE分析发现 ,该酶分子量为 6 8kD ,薄层等电聚焦测得等电点为 3 5 .漆酶Ⅰ的底物范围较宽 ,以O2 为电子受体 ,可以氧化多种木素单体模型物 ,包括 2 ,6 二甲氧基酚 ,2 ,2′ 联氮 二 (3 乙基 苯并噻唑 6 磺酸 )(ABTS) ,愈创木酚 ,咖啡酸 ,阿魏酸和邻联茴香胺 .结果表明 ,该酶在木质素的生物降解中可能有重要的作用和应用价值 .     

桦褶孔菌漆酶固定化及其对染料的降解

采用壳聚糖交联法和海藻酸钠-壳聚糖包埋交联法固定化桦褶孔菌产生的漆酶,探讨最佳固定化条件,固定化漆酶的温度,pH稳定性及操作稳定性,并以两种固定化酶分别对4种染料进行了降解.结果表明:(1)壳聚糖交联法固定化漆酶的最佳条件为:壳聚糖2.5%,戊二醛7%,交联时间2h,固定化时间5h,给酶量1g壳聚糖小球:1mL酶液(1U/mL),固定化效率56%;(2)海藻酸钠-壳聚糖包埋交联法固定化漆酶的最佳条件为:海藻酸钠浓度4%,壳聚糖浓度0.7%,氯化钙浓度5%,戊二醛浓度0.6%,给酶量4mL 4%海藻酸钠:1mL酶液(1U/mL),固定化效率高达86%;(3)固定化的漆酶相比游离漆酶有更好的温度和pH稳定性;(4)比较两种固定化漆酶,海藻酸钠-壳聚糖包埋交联法固定化酶的温度及酸度稳定性要优于壳聚糖固定化酶,但可重复操作性要弱于后者,两者重复使用8次后的剩余酶活比率分别为71%及64%;(5)两种固定化酶对所选的4种不同结构的合成染料均有较好的降解效果,其中壳聚糖固定化酶对茜素红的降解效果及重复使用性极佳,重复降解40mg/L的茜素红10次,降解率仍保持在100%.     

改构的野生革耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达和活性鉴定

在野生革耳漆酶的cDNA序列3’端添加15个核苷酸后得到突变基因lccT。将其克隆入表达载体pPICZαA,重组质粒pPICZαA／lccT经PmeⅠ线性化,电击转化毕赤酵母X-33细胞。经过菌落PCR鉴定的转化子pPICZαA／lccT—X一33在甲醇诱导后分泌表达活性重组漆酶LCCT,比未添加该段序列的野生革耳漆酶基因lcc在毕赤酵母中表达的活性提高2倍多。其培养液上清经凝胶过滤层析和离子交换层析后,得到了电泳纯的漆酶蛋白,以ABTS为底物在pH4．5时测得比活为3．68U／mg。根据SDS-PAGE测定的重组漆酶LCCT的表观相对分子质量为62600。     

黑木耳漆酶纯化的研究

目的:研究黑木耳(Auricularia auricula)“黑29”的漆酶纯化,为进一步酶学性质的开展、酶应用和酶基因克隆提供理论基础。方法:采用硫酸铵分级沉淀和柱层析技术分离蛋白,通过PAGE和SDS-PAGE电泳检测蛋白。结果:SDS-PAGE电泳检测发现粗酶液含三种漆酶,分子量大小分别为LacA(60kD)、LacB(34kD)、LacC(19kD);纯化后获得纯化的单一漆酶LacA、LacC组分。结论:得漆酶两个单一组分,为进一步漆酶研究奠定基础。     

漆酶空间结构、反应机理及应用

漆酶 (EC 1.10.3.2) 属于多铜氧化酶家族,可以催化氧化酚类和芳香类化合物,利用自由基反应机理完成4个电子的转移,并将分子氧还原成水。漆酶具有非常保守的拓扑学结构,结合作者自身工作实践,对漆酶结构与功能的最新研究进展进行综述,其中对漆酶的三维结构、活性中心、催化机理研究和最新的应用进展作重点阐述。     

漆酶在对苯二甲酰氯-己二胺缩聚物载体上的固定:物理吸附及共价偶联的比较

以对苯二甲酰氯(PPTC)和己二胺(HD)的缩聚物作为固定云芝漆酶的载体,研究了物理吸附和化学偶联两种方法对漆酶固定量、固酶比活力、固定漆酶的热稳定性、重复使用性的影响。此外还进一步研究了不同固定策略对固定漆酶动力学参数的影响。实验结果表明:无论采用物理吸附法或是化学偶联法都具有较高的固酶量和固酶比活力。两种方法的固酶量和固定漆酶的比活力分别为:物理吸附法-126 mg/g,1.65 U/mg;化学偶联法-92 mg/g,0.65 U/mg。通过比较两种不同的固酶策略对固酶热稳定性、重复使用性及酶动力学参数的影响后发现:化学偶联法固定漆酶的热稳定性及重复使用性能均优于物理吸附法,但此种方法固酶的表观催化氧化反应速率常数kcat低于物理吸附法固定漆酶的kcat。综合比较,以对苯二甲酰氯与己二胺缩聚物为固酶基元采用化学偶联法固定漆酶应为固定游离漆酶的一种较好的可行方法。     

粗毛栓菌胞外锰过氧化物酶的纯化及性质

培养于麦草粉上的白腐担子菌粗毛栓菌分泌胞外木质纤维素降解酶(纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶)。经过超滤、盐析、离子交换层析、凝胶过滤和活性聚丙烯酰胺凝胶电泳等步骤,获得了初步纯化的锰过氧化物酶组分。利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电点聚焦技术所测定的锰过氧化物酶的相对分子质量和等电点分别为35.7 ku和pI 2.8。研究结果表明,所纯化的锰过氧化物酶在407nm处具有最大光吸收峰,该酶最适作用pH值和温度分别为pH 5.3和35℃。     

灵芝EIM-40漆酶的分离纯化及酶学性质

采用冻干浓缩、（NH4）2S04盐析、HiTrapphenyl（FF）疏水层析和QSepharose FastFlow离子交换层析对灵芝EIM-40发酵液进行分离纯化,获得纯化漆酶,纯化倍数为14．6,回收率为5．3％。SDS-PAGE银染的结果为单一条带,相对分子质量约为6．53×104。以愈创木酚和2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）为催化底物进行酶学性质研究,最适pH分别为4．8和4．5,最适温度分别为55和50℃,2种底物在pH4．0。5．0范围内,温度低于50℃时,酶的稳定性都很好。以愈创木酚为底物,Km=645．0umol／L;以ABTS为底物,Km=22．2txmol／L。Cu2＋对该酶起激活作用,Fe2＋、Ca2＋、Ba2＋则完全抑制酶的活性。     

白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质

对白腐菌W 1产生的漆酶粗酶液通过超滤浓缩、分子筛和离子交换层析进行纯化 .用SDS PAGE证明该酶的分子量大约为 6 2 4kD .等电聚焦电泳显示该酶的等电点为 3 5 .酶反应的最适温度为 5 0℃ ,最适pH值为 4 5 .此酶氧化DMP的Km 值为 3 84× 10 -5mol L .金属离子对酶活的影响很大 ,其中K+ 、Mn2 + 、Ag+ 对酶活有促进作用 ,Fe2 + 、Fe3 + 、Hg2 + 、Co2 + 、Ba2 + 等对酶活有明显的抑制作用 .酶对部分染料也有一定的脱色效果     

一种pH稳定的黄色漆酶的快速纯化和性质特征

通过丙酮沉淀和 DEAE- cellulose DE52 柱层析, 快速、有效地从一株白腐菌 Trametes sp. SQ01 的发酵液中纯化了漆酶。纯化的漆酶并非传统漆酶那样呈现蓝色, 而是一种黄色蛋白。以 ABTS 为底物时, 该酶的最适 pH 和温度分别是 pH 4.5 和 70°C, Km 为 0.029 mmol/L。T. SQ01 漆酶在 pH 3.0~11.0时, 酶活相对稳定, 在 pH 5.0 时最为稳定, 是目前报道的 pH 稳定性最好的漆酶。低浓度的金属离子(1 mmol/L) Cu2+、Mg2+ 、Ca2+ 和Co2+ 对漆酶有促进作用, 而高浓度(5 mmol/L)的Co2+、Zn2+、 Mn2+、Mg2+ 却抑制漆酶酶活。SDS 对该酶有激活作用, 当其浓度为1 mmol/L时, 漆酶相对酶活达到128%。DTT对漆酶强烈抑制, 即使是浓度为1 mmol/L, 亦可完全抑制漆酶酶活。纯化后的漆酶对亮蓝(RBBR) (100 mg/L)的脱色能力显著, 0.5 U/mL 的漆酶在 10 min内即可达到 80%的脱色率。T. sp. SQ01 漆酶的快速纯化以及高效脱色的能力表明该酶在染料脱色降解方面有着广阔的应用前景。     

白腐真菌漆酶的纯化及性质

液体发酵培养白腐真菌F9,粗酶液经盐析、透析浓缩、葡聚糖G-100柱层析、DEAE-纤维素离子交换层析四步分离纯化,得电泳纯漆酶。经SDS-PAGE法测定酶的相对分子质量约为6×104,酶活回收率达46.47%,纯度提高了18.86倍。F9漆酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.8,在35℃以下、pH 4.8～5.4的范围内稳定性较强。其催化愈创木酚的Km为4.61 mmol/L,vm为6.27 mmol/(L.min)。K+对其有激活作用,而Fe2+、Fe3+对其有明显抑制作用。     

生物酶催化聚合的研究进展

酶催化聚合反应是近年来的研究热点之一,氧化还原酶是应用广泛的一类催化聚合酶。概括总结了近年来酶促聚合反应的研究进展,重点叙述了辣根过氧化物酶(HRP)、大豆过氧化物酶(SBP)和漆酶(laccase)的结构、催化机理以及它们在酶催化聚合中的应用概况。