Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Envelope Protein Ion Channel Activity Promotes Virus Fitness and Pathogenesis

Deletion of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV) envelope (E) gene attenuates the virus. E gene encodes a small multifunctional protein that possesses ion channel (IC) activity, an important function in virus-host interaction. To test the contribution of E protein IC activity in virus pathogenesis, two recombinant mouse-adapted SARS-CoVs, each containing one single amino acid mutation that suppressed ion conductivity, were engineered. After serial infections, mutant viruses, in general, incorporated compensatory mutations within E gene that rendered active ion channels. Furthermore, IC activity conferred better fitness in competition assays, suggesting that ion conductivity represents an advantage for the virus. Interestingly, mice infected with viruses displaying E protein IC activity, either with the wild-type E protein sequence or with the revertants that restored ion transport, rapidly lost weight and died. In contrast, mice infected with mutants lacking IC activity, which did not incorporate mutations within E gene during the experiment, recovered from disease and most survived. Knocking down E protein IC activity did not significantly affect virus growth in infected mice but decreased edema accumulation, the major determinant of acute respiratory distress syndrome (ARDS) leading to death. Reduced edema correlated with lung epithelia integrity and proper localization of Na⁺/K⁺ ATPase, which participates in edema resolution. Levels of inflammasome-activated IL-1β were reduced in the lung airways of the animals infected with viruses lacking E protein IC activity, indicating that E protein IC function is required for inflammasome activation. Reduction of IL-1β was accompanied by diminished amounts of TNF and IL-6 in the absence of E protein ion conductivity. All these key cytokines promote the progression of lung damage and ARDS pathology. In conclusion, E protein IC activity represents a new determinant for SARS-CoV virulence.     

SARS病毒N蛋白、E蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

本研究通过RT-PCR反应获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(E)基因,将n基因和e基因克 隆到大肠杆菌表达载体pGEX-KG上,并在大肠杆菌中以可溶形式获得高效表达,表达产物经亲和层析纯化。重 组蛋白N与SARS病毒抗体呈现特异性的反应,为进一步研究SARS病毒感染免疫应答机制和早期诊断奠定基础     

SARS病毒N蛋白、E蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

本研究通过RT-PCR反应获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(E)基因,将n基因和e基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX KG上,并在大肠杆菌中以可溶形式获得高效表达,表达产物经亲和层析纯化.重组蛋白N与SARS病毒抗体呈现特异性的反应,为进一步研究SARS病毒感染免疫应答机制和早期诊断奠定基础     

SARS病毒M蛋白的二级结构和B细胞表位预测

以SARS病毒基因组序列为基础,采用GarnierRobson方法、ChouFasman方法和KarplusSchulz方法预测蛋白质的二级结构;按KyteDoolittle方案、Emini方案和JamesonWolf方案预测SARS病毒M蛋白的B细胞表位。预测结果表明,在SARS病毒M蛋白N端第11～20、27～36区段和第133～141区段可能是α螺旋中心;M蛋白分子N端第20～27、34～37,44～56,61～64,70～76,79～97,117～132,142～147,165～176区段和第216～221区段可能是β折叠中心。在M蛋白N端第5～6、40～44、105～107、112～116、189～190、202～203区段和第210～215区段具有较柔软的结构,有可能进行一定幅度的摆动或折叠而形成较复杂的三级结构。SARS病毒M蛋白N端第1～15、37～47、99～120、181～192区段和第196～215区段内或附近很可能是B细胞表位优势区域。以蛋白质的二级结构预测作为辅助手段,用抗原指数,亲水性参数和可及性参数预测SARS冠状病毒M蛋白的B细胞表位,为实验确定SARS病毒M蛋白的B细胞表位和免疫识别研究奠定了基础 。     

重组SARS冠状病毒刺突蛋白的表达和分离纯化

SARS冠状病毒的感染能引发人的严重急性呼吸综合征。根据对其他种类冠状病毒的研究结果 ,刺突(spike)蛋白 (S蛋白 )是病毒的主要表面抗原 ,重组S蛋白可用于临床诊治 ,疫苗制备和结构生物学研究。SARS病毒S蛋白基因被分段和完整地克隆到不同的细菌表达载体进行了表达。通过宿主菌的选择和条件的优化 ,其中75 1～ 192 5bp、2 0 0 5～ 3410bp、1～ 192 5bp、32～ 36 5 9bp片段及全长 1～ 376 8bpDNA都在大肠杆菌中实现了高效表达 ,表达量分别占菌体蛋白质的 35 %、34%、2 4 %、17%和 5 % ,并经亲和层析得到了部分纯化。纯化后的蛋白质将用于诊断试剂和结构生物学研究。     

SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp的原核表达

严重急性呼吸综合征病毒,即SARS冠状病毒((Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV),为具有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组约长29~31kb。基因组从5'到3'端依次编码复制酶蛋白(Rep)、刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)以及其他一些辅助性蛋白[1]。编码复制酶蛋白的基因,从基因组5'端起约占全长的2/3区域(≈21.2kb),在该区域的nt13392-13398存在保守的UUUAAAC位点,此位点含有-1位的核糖体翻译移框(frameshift),可引发自单一起始位点的蛋白翻译扩展,即由ORF1a编码的Pp1a(约486kDa)扩展为由ORF1b编…     

SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp的原核表达

严重急性呼吸综合征病毒,即SARS冠状病毒((Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV),为具有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组约长29～31kb.基因组从5′到3′端依次编码复制酶蛋白(Rep)、刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)以及其他一些辅助性蛋白[1].     

SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选及抑制动力学研究

对SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS-CoV M^pro)进行异源重组表达与提纯,并以其为靶点,利用基于荧光共振能量转移(FRET)技术的体外药物筛选模型,对蛋白酶抑制剂聚焦库96种化合物进行了体外抑制活性的评价,并从动力学的角度探讨筛选出的阳性化合物对SARS-CoV M^pro的抑制能力与机制。结果表明:通过筛选获得抑制率>80%、淬灭率<20%的化合物5种,为P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-28、P-2-54,其半数有效抑制浓度(IC₅₀)分别为:0.69±0.05μmol/L、1.19±0.41μmol/L、0.14±0.01μmol/L、1.36±0.07μmol/L、0.36±0.03μmol/L。其中化合物P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-54对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制作用为不可逆抑制,化合物P-2-28的抑制作用为可逆抑制。根据Lineweaver-Burk图和Dixon图的研究,发现化合物P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶呈竞争性抑制,抑制常数Ki为0.81μmol/L。通过对底物浓度,IC₅₀值及Ki值关系的研究,进一步验证了P-2-28的抑制作用为竞争性抑制。该抑制剂的发现为SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的研究打下基础,为抗SARS病毒药物开发提供了先导化合物。     

严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的鉴定与分析

利用293细胞对SARS病人样品进行病毒扩增,培养上清中病毒颗粒经过纯化后,利用蛋白质组学技术,对纯化得到的SARS冠状病毒颗粒蛋白进行初步分离与鉴定。其中质谱分析结果最终表明,分子量约150kD的蛋白质的氨基酸序列与SARS—CoV基因组所预测S蛋白质序列高度吻合,从而首次从蛋白质水平对SARS冠状病毒S蛋白的氨基酸序列进行了证实。     

严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒核蛋白的鉴定与分析

利用蛋白质组学技术,对纯化的严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒颗粒所含核蛋白进行初步分离与鉴定。质谱分析结果最终表明,SARS冠状病毒核蛋白的分子量位于47kD与52kD之间,所获得的SARS冠状病毒核蛋白的质谱分析数据覆盖了所预测病毒核蛋白氨基酸序列的87％,且符合率为100％。从而首次从蛋白质水平对SARS冠状病毒核蛋白的氨基酸序列进行了证实。     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白抑制胞质分裂和细胞增值

目的:SARS冠状病毒(SARS-CoV)的核衣壳蛋白(N蛋白)能够结合病毒RNA形成螺旋状的核衣壳。在3种不同的细胞系中分别表达SARS-CoVN蛋白,研究它对转染细胞生长的影响。方法:将重组质粒pEGFP-N和pEGFP(作为对照)分别转染人胚肾HEK293细胞、成纤维细胞3T3、人宫颈癌HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜、荧光显微镜观察SARS-CoVN蛋白在细胞内的定位以及细胞的生长变化。结果:SARS-CoVN蛋白能定位于细胞质,并不像其他冠状病毒N蛋白那样能够定位到细胞核。同时发现SARS-CoVN蛋白能够诱导形成多核细胞,多核细胞的百分率可达33.9%。结论:SARS-CoVN蛋白抑制胞质分裂,延缓细胞生长。     

SARS冠状病毒M蛋白的原核表达及其DNA疫苗构建

为探讨SARS-CoV的M蛋白的免疫学特性以及M蛋白作为SARS-CoV病毒疫苗组分的可行性和必要性.分别用pET-15b和pET-22b在大肠杆菌中表达SARS-CoV的M蛋白,亲和层析纯化后作为抗原应用.同时,将M蛋白的编码基因克隆进分泌型真核表达载体pSecTagB中得到重组质粒pSecM作为DNA疫苗,免疫BALB/c小白鼠、制备SARS-CoV M蛋白的抗血清.并用纯化后的M蛋白建立的SARS-CoV M抗体ELISA检测技术研究所构建的M-DNA疫苗的免疫效果.结果表明:两种重组M蛋白在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,经与华大产的用灭活SARS全病毒制备的SARS-CoV抗体ELISA检测试剂盒比较实验,证明该原核表达的重组M蛋白能与SARS确诊病人血清以及M-DNA免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应.这两种重组M蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS-CoV检测中;所构建的SARS-CoV的M基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,提示M蛋白在SARS-CoV疫苗尤其是组分疫苗的研制中应加以考虑,为DNA疫苗的开发提供了依据.     

SARS病毒核蛋白基因的克隆及其表达研究

从一例输入性传染性非典型性肺炎病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增出SARS病毒核蛋白基因片段,克隆入质粒载体pUCm-T后,进行核苷酸序列的测定及分析,与已公布的SARS病毒基因序列进行比较,证实为SARS冠状病毒核蛋白基因.为了解该病毒核蛋白的抗原特性,将核蛋白基因插入表达载体,构建重组质粒pET28a-SN,转导大肠杆菌BL21(DE3)后,加IPTG诱导表达.产物经SDS-PAGE电泳分析,表达出相对分子量约为50kDa的蛋白,占整个菌体的45%左右.Western-blot分析表明,表达产物仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常血清不起反应.间接ELISA免疫检测,抗原滴度达112500.表明表达的核蛋白为SARS特异性抗原,这为SARS病毒的诊断试剂的研制提供了方便而安全的抗原来源.     

SARS病毒核蛋白基因的克隆及其表达研究

从一例输入性传染性非典型性肺炎病人血清中提取病毒RNA,通过RT—PCR方法扩增出SARS病毒核蛋白基因片段,克隆入质粒载体pUCm—T后,进行核苷酸序列的测定及分析,与已公布的SARS病毒基因序列进行比较,证实为SARS冠状病毒核蛋白基因。为了解该病毒核蛋白的抗原特性,将核蛋白基因插入表达载体,构建重组质粒pET28a—SN,转导大肠杆菌BL21(DE3)后,加IPTG诱导表达。产物经SDS—PAGE电泳分析,表达出相对分子量约为50kDa的蛋白,占整个菌体的45％左右。Westem—blot分析表明,表达产物仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常血清不起反应。间接ELISA免疫检测,抗原滴度达1：12500。表明表达的核蛋白为SARS特异性抗原,这为SARS病毒的诊断试剂的研制提供了方便而安全的抗原来源。     

SARS冠状病毒M蛋白的原核表达及其DNA疫苗构建

为探讨SARS-CoV的M蛋白的免疫学特性以及M蛋白作为SARS-CoV病毒疫苗组分的可行性和必要性.分别用pET-15b和pET-22b在大肠杆菌中表达SARS-CoV的M蛋白,亲和层析纯化后作为抗原应用.同时,将M蛋白的编码基因克隆进分泌型真核表达载体pSecTagB中得到重组质粒pSecM作为DNA疫苗,免疫BALB/c小白鼠、制备SARS-CoV M蛋白的抗血清.并用纯化后的M蛋白建立的SARS-CoV M抗体ELISA检测技术研究所构建的M-DNA疫苗的免疫效果.结果表明两种重组M蛋白在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,经与华大产的用灭活SARS全病毒制备的SARS-CoV抗体ELISA检测试剂盒比较实验,证明该原核表达的重组M蛋白能与SARS确诊病人血清以及M-DNA免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应.这两种重组M蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS-CoV检测中;所构建的SARS-CoV的M基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,提示M蛋白在SARS-CoV疫苗尤其是组分疫苗的研制中应加以考虑,为DNA疫苗的开发提供了依据.     

重组SARS冠状病毒M蛋白的表达、纯化及鉴定

SARS冠状病毒是人的严重急性呼吸综合征的病原体。根据对其他种类冠状病毒的研究结果 ,膜蛋白 (M蛋白 )是病毒主要的结构蛋白 ,重组M蛋白可被用来作为抗原检测对应冠状病毒的感染和制备疫苗。SARS病毒M蛋白基因克隆到原核表达载体pMAL cRI中 ,利用N端和C端分别融合麦芽糖结合蛋白 (maltosebindingprotein和MxeGyrAinteinCBD的策略 ,在大肠杆菌中初步表达了重组M蛋白 ,并通过Western印迹和质谱对蛋白质进行了鉴定。重组蛋白质经亲和层析得到了部分纯化 ,纯化后的蛋白质将用于功能研究与诊断试剂盒的研制。     

NMR Structure and Ion Channel Activity of the p7 Protein from Hepatitis C Virus

The small membrane protein p7 of hepatitis C virus forms oligomers and exhibits ion channel activity essential for virus infectivity. These viroporin features render p7 an attractive target for antiviral drug development. In this study, p7 from strain HCV-J (genotype 1b) was chemically synthesized and purified for ion channel activity measurements and structure analyses. p7 forms cation-selective ion channels in planar lipid bilayers and at the single-channel level by the patch clamp technique. Ion channel activity was shown to be inhibited by hexamethylene amiloride but not by amantadine. Circular dichroism analyses revealed that the structure of p7 is mainly α-helical, irrespective of the membrane mimetic medium (e.g. lysolipids, detergents, or organic solvent/water mixtures). The secondary structure elements of the monomeric form of p7 were determined by ¹H and ¹³C NMR in trifluoroethanol/water mixtures. Molecular dynamics simulations in a model membrane were combined synergistically with structural data obtained from NMR experiments. This approach allowed us to determine the secondary structure elements of p7, which significantly differ from predictions, and to propose a three-dimensional model of the monomeric form of p7 associated with the phospholipid bilayer. These studies revealed the presence of a turn connecting an unexpected N-terminal α-helix to the first transmembrane helix, TM1, and a long cytosolic loop bearing the dibasic motif and connecting TM1 to TM2. These results provide the first detailed experimental structural framework for a better understanding of p7 processing, oligomerization, and ion channel gating mechanism.