蚕豆萎焉病毒2感染豌豆叶细胞后引起的线粒体增生和聚集

应用超薄切片和免疫金标记电镜技术,结合体视学分析研究了受蚕豆萎焉病毒2（BBWV2）中国分离物B935侵染的豌豆（Pisumsativum）叶细胞中线粒体的异常变化。结果表明,感病细胞线粒体增生并聚集于细胞质的膜增生区周围。体积增大,形状畸变,一些线粒体内含有类结晶包涵体。病叶细胞与健康对照之间线粒体的体积密度（Vv）、表面积密度（Sv）、数密度（Nv）等参数存在显著差异（P〈0．01）,而形状因子（PE）、周长指数（CI）、比表面积（Rsv）等参数随不同病变阶段而有变化。在线粒体周围及线粒体之间的网格结构可被BBWV2金标记抗体特异性标记。推断为正在组装的病毒粒子。子代病毒形成结晶体和管状体,有高密度的免疫金颗粒标记。上述研究结果提示BBWV2引起的细胞线粒体异常变化与病毒复制组装有关。聚集线粒体的外膜粘连面可能是病毒粒子组装部位。一些线粒体内的类结晶包涵体可能代表了某种蛋白质异常积累。     

蚕豆萎蔫病毒2号分离物侵染对蚕豆叶片光合活性和叶绿体超微结构的影响

研究了受蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV2）中国分离物B935和欧洲分离物PV131侵染的蚕豆（Vicica faba）叶片光合特性、叶绿素荧光诱导动力学参数和叶绿体超微结构变化。感病蚕豆叶绿素含量减少,叶绿素a／b比逐步降低;光合气体交换参数Pn值和Gs值降低,Ci值升高;叶绿素荧光诱导动力学参数Fv/Fm、FV＇/Fm＇、ΦPSII、qP值均有不同程度降低,NPQ值升高;光合器结构遭到不同程度的破坏,B935侵染后叶绿体发育不良,片层结构疏松,PVl31侵染后叶绿体肿胀变圆,片层结构疏松瓦解。与B935相比,PV131侵染对以上各参数的变化有更大影响,且对叶绿体的破坏更为严重。实验结果表明BBWV2不同分离物对光系统II（PSII）的抑制作用与光合器受损程度相关。     

与蚕豆萎蔫病毒2号胞间运动和长距离转运相关的寄主细胞超微结构研究

电镜超微结构观察和免疫金标记显示:受蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV 2)中国分离物B935侵染的豌豆(Pisum sativum)和蚕豆(Vicia faba)叶细胞中膜结构增生,形成膜结构增生区,病毒以结晶体和管状体形式存在于细胞质中。在病变早期,叶肉细胞的胞间连丝处连接有小管结构,病毒样颗粒呈纵列排在小管中,穿越胞间连丝的小管能被BBWV 2的金标记抗体特异性标记。维管束组织的薄壁细胞、伴胞及转移细胞内存在膜增生区及病毒管状体,在筛管壁附近存在的病毒样颗粒能被BBWV 2金标记抗体特异性标记。实验结果表明BBWV 2胞间运动形式与豇豆花叶病毒(CPMV)相似,以完整粒子通过在胞间连丝处形成的小管结构穿越胞间连丝;细胞质中存在的直径160nm管状体只是一种病毒聚集体,与胞间运动无直接关系;该病毒在筛管中可能也是以完整粒子形式进行长距离转运的。     

蚕豆萎蔫病毒2号山西分离株的全基因组序列测定与分析

本试验在生物学接种的基础上,利用非序列依赖性PCR扩增（sequence-independent amplification,SIA）对感病青椒（Capsicum annuum）进行了分子鉴定. 序列测定及分析发现,侵染青椒的病毒为蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2, BBWV2）. 为明确BBWV2青椒分离物（BBWV2 Ca）的分类地位,对BBWV2 Ca的全基因组序列进行了分段克隆、序列测定和分析. BBWV2-Ca RNA1全长5 929 bp,含有1个ORF. BBWV2 Ca RNA2全长3 559 bp,含有1个ORF,编码3种蛋白：VP53/VP37、外壳蛋白大亚基（large coat protein, LCP）和外壳蛋白小亚基(small coat protein, SCP). 全序列核苷酸同源性分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在77.9%～93.7%之间|RNA2与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在80.2%～93.8%之间. 全序列系统进化分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2-XJ14-3以及BBWV2-RP3株系聚为一簇,亲缘关系最近|RNA2与BBWV2-Am形成一个独立分支,亲缘关系最近.     

侵染白术的蚕豆萎蔫病毒2号的分子检测与序列分析

为鉴定引起山西绛县白术花叶、黄化等症状的病原,利用生物学接种、非序列依赖性PCR扩增(SIA)和RTPCR的研究方法,对白术病样进行了研究,结果表明:接种感病白术病汁液的指示植物昆诺藜表现退绿枯斑,经单斑分离后转接健康白术植株呈现出与病样类似的症状,初步证明白术病害可能为病毒引起的;SIA检测表明感病白术为蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)侵染所致;为明确BBWV2白术分离物(BBWV2-Am)的分类地位,进一步克隆了BBWV2-Am RNA2外壳蛋白大亚基基因(LCP)和外壳蛋白小亚基基因(SCP)序列;序列同源性分析表明,LCP基因和SCP基因与已发表的BBWV2其它株系相应基因核苷酸序列的同源性分别为79.3%~87.2%和80.1%~89.2%,氨基酸序列同源性分别为91.2%~95.7%和89.4%~95.5%;系统进化树分析显示,BBWV2-Am与BBWV2地黄分离物(BBWV2-Rg)形成一个独立分支,二者亲缘关系最近。这是BBWV2侵染白术的首次报道。     

番茄斑萎病毒运动蛋白NSm在植物细胞和昆虫细胞内的定位

[目的]研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)运动蛋白NSm的细胞定位.[方法]将NSm基因融合GFP后构建到植物双元表达载体pCHF3中,农杆菌介导浸润本氏烟叶片,同时将融合GFP的NSm基因利用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系转染昆虫Tn细胞.在激光共聚焦显微镜下观察NSm-GFP在烟草表皮细胞和昆虫Tn细胞中的定位情况.[结果]观察发现与单独表达GFP在细胞壁周围和细胞核处均匀分布不同,NSm-GFP融合蛋白会在植物细胞内扩散,能够在细胞壁边缘定位,并且在胞间连丝处呈不连续的绿色荧光小点,偶尔成对出现在相邻的两个细胞之间;NSm蛋白在昆虫Tn细胞表面产生数量众多的管状结构并向外延伸.[结论]研究结果表明NSm能够特异性定位在植物细胞的胞间连丝处,并能在昆虫Tn细胞内表达,在细胞表面产生运动蛋白小管.     

猪瘟病毒E2蛋白A3BCD主要抗原结构域的原核表达

目的：对猪瘟病毒E2蛋白A3BCD进行原核表达,以期获得具有抗原活性的表达产物。方法：利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nPCR）技术从河南省近期流行猪瘟病毒野毒株中扩增得到E2基因,并将其克隆至pUCm-T载体,构建克隆载体pUCm-TE2;利用PCR方法扩增E2基因的主要抗原域A3BCD,克隆至pET-32a（＋）载体,构建表达载体pET-32aE2-2,转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）中,用IPTG进行诱导表达,对诱导产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果：SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约35000处出现预期条带,表达产物主要以包涵体形式存在;Western-blotting检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带;用8mol／L尿素（pH8.0）溶解包涵体,经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得纯度较高的目的蛋白,ELISA检测表明能与猪瘟抗体阳性血清发生特异性反应。结论：重组质粒pET-32aE2-2转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,解除了由于稀有密码子造成的表达限制,表达量得到提高;表达产物为硫氧还蛋白和E2-2的融合蛋白,易于纯化,且具有活性,为研制猪瘟抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

将近期引起传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-VP2。对重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用IBDV抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应,抗原效价达到1.6×103;用Western blotting分析,在53kDa处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组Vp2蛋白能够自组装成病毒样颗粒,在感染细胞中发现了"包涵体样"结构。用HisTrap HP亲和层析柱纯化的重组Vp2蛋白作为包被抗原,建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。用重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞裂解物,免疫2周龄SPF鸡,一次免疫14d后,ELISA检测抗体效价为8×102,中和抗体效价为1106,攻毒实验的存活率为30%;二次免疫14d后,ELISA抗体效价为3.2×103,中和抗体效价为2536,存活率为100%。在实验观察7d内,重组Vp2蛋白免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化,法氏囊/体重比高于对照组(P0.05)。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和检测试剂方面显示出了应用前景。     

SO2衍生物诱发蚕豆根尖细胞微核和后期异常的研究

研究SO₂体内衍生物--亚硫酸钠和亚硫酸氢钠混合液(3:1 mmol·L^-1/mmol·L^-1)诱发蚕豆根尖细胞微核和后期异常的效应。结果表明:SO₂衍生物处理可诱发蚕豆根尖间期细胞微核和核芽,使分裂后期出现多种染色体异常,如断片、桥以及滞后染色体等。异常细胞中以微核细胞和染色体断裂细胞居多。在一定浓度范围内,细胞异常率与处理液浓度之间表现正的线性相关。这些研究结果表明,蚕豆根尖间期微核和后期染色体异常有可能用作检测SO₂污染的生物剂量计。     

Bcl-2家族蛋白调控线粒体膜通透性和细胞色素C释放的新机制

Bcl-2家族蛋白在调控线粒体功能和细胞色素C释放中起重要作用。最近发现Bcl-2分子通过与其他促凋亡分子相互作用调控线粒体外膜通透性,其具体分子机制尚不完全清楚。本课题组采用化学生物学方法,在研究Bax/Bak非依赖的细胞凋亡途径中,发现了一些小分子化合物能够诱导Bim表达量急剧升高,Bim能转位到线粒体上,与Bcl-2相互作用增强,并直接促进Bcl-2构象变化。有意义的是,Bim可以诱导Bcl-2功能发生转换并能够形成大的复合体通道来介导细胞色素C释放。研究结果提示Bcl-2分子可变成促凋亡分子,参与Bax/Bak非依赖的细胞色素C释放和细胞凋亡。     

烟草叶片发育过程中光合功能衰退与H_2O_2积累的关系

以烟草(NicotianatabacumL.cvNC89)为材料,研究了叶片发育过程中H2O2积累与叶绿体光合功能衰退、抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环的关联。结果表明,光合功能衰退过程中,各光合参数均表现为先缓慢后快速的下降趋势,核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBPCase)活性下降较电子传递活性下降迅速,H2O2含量与叶绿素含量、光合速率、RuBPCase活性、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性显著负相关。H2O2的定位染色也证实光合功能衰退与H2O2积累密切相关。APX和GR在光合功能可逆衰退阶段维持较高水平,不可逆衰退阶段下降稍快。烟草叶片光合功能衰退快于AsA-GSH循环运转的下调。     

Cd2+处理对菹草叶片保护酶活性和细胞超微结构的毒害影响

以不同浓度Cd^2 处理5d的菹草为实验材料,测定了叶片SOD,POD,CAT等生理生化指标的变化,并用透射电镜观察了Cd^2 对叶细胞超微结构,尤其是对叶绿体,线粒体和细胞核的损伤情况。结果表明：SOD活性,叶绿素含量随Cd^2 处理浓度的增加而下降,而CAT和POD活性都是在1mg／L浓度下达到峰值,而后降低。SOD对Cd^2 毒害最敏感,其次为POD和CAT。电镜观察发现：随Cd^2 浓度的增加,对细胞超微结构的损伤程度也加剧。表现为叶绿体膨大,被膜断裂、消失和叶绿体解体;线粒体变形,脊突膨大和空泡化;细胞核核仁分散,核膜断裂,核空泡化。并探讨了Cd^2 对植物的毒害机制。     

不同CO_2浓度与温度条件下马铃薯叶片的淀粉浓度与比叶重和矿质元素浓度的关系(英文)

三个马铃薯(Solanum tuberosum L.)品种在500、1000、1500、2000μmol·mol~(-1)CO_2浓度与16、20℃空气温度下生长35d,测定了植株叶片的比叶重(g·m~(-2))、淀粉浓度及主要养分N、P、K、Ca、Mg的浓度。在16℃和20℃下,叶片淀粉浓度随CO_2浓度的增加而增加,且16℃下的测定值高于20℃下的测定值。比叶重与以叶面积或干重为基础的叶片淀粉浓度成正相关。叶片N、P、Ca、Mg浓度与14％范围内的淀粉浓度成负相关,但与高于14％的淀粉浓度无明显关系。去除淀粉效应后的比叶重及叶片养分浓度呈现类似的变化趋势。然而,不同CO_2浓度下的叶片K浓度相对稳定,因此受淀粉浓度影响较小。研究结果表明,不同CO_2浓度与温度条件下马铃薯叶片的比叶重及N、P、Ca、Mg浓度的变化不完全是叶片淀粉浓度的变化所致。