人白细胞介素－3在大肠杆菌中的高效表达

人白细胞介素－３（ｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３,ｈＩＬ－３）是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用ＰＣＲ方法从人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出０．４４ｋｂ的ＤＮＡ片段,并克隆入ｐＵＣ１９载体中。经ＤＮＡ序列测定,确定０．４４ｋｂ的ＰＣＲ产物合完整的编码人白细胞介素－３成熟蛋白ｃＤＮＡ序列,并在信号肽与成熟蛋白编码序列之间通过突变引入了限制性内切酶位点和ＡＴＧ起始密码。构建的ＰＬ启动子控制下的ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ表达质粒,转入大肠杆菌Ｔａｐ１０６,经４２℃热诱导,获得ｈＩＬ－３的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为１５ｋｄ,约占细菌总蛋白的１５％。表达产物经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证。ｈＩＬ－３表达产物在细胞内形成包涵体,纯化包涵体,使产物纯度提高到７０．８％,产物复性后,能明显促进ｈＩＬ－３依赖细胞株生长,具有明显的生物活性。产物转移到ＰＶＤＦ膜后进行Ｎ端序列分析,Ｎ端１６个氨基酸正确。     

人白细胞介素1受体抗剂cDNA克隆及其表达影响因素

采用ＰＣＲ技术成功地从人胎盘ｃＤＮＡ文库中扩增出人白细胞介素１受体拮抗剂成熟蛋白编码区基因，并以此为模板突变其ｃＤＮＡ５；其克隆产物经物理图谱证实与文献报道完全一致，     

hIL—5cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

从人外周血中分离淋巴细胞,经ＰＭＡ和钙离子载体Ａ２３１８７诱导,通过ＲＴ－ＰＣＲ技术获得ｈＩＬ－５ｃＤＮＡ片段。扩增其编码成熟多肽的ｃＤＮＡ片段插入ｐＢＶ２２０,在大肠杆菌ＤＨ５α中诱导表达,未能得到预期１４ｋＤ的重组蛋白的表达,只有一个克隆高效表达约１０ｋＤ的小肽。对该克隆测序表明,其ｃＤＮＡ缺失一个Ａ,导致在８６位氨基酸处于开始移码,高效表达一个９３个氨基酸的小肽。     

人白细胞介素—3基因翻译起始区的改造提高其在大肠杆菌中的表…

为了提高人白细胞介素－３（ｈＩＬ－３）在大肠杆菌中的表达,在计算机辅助下,设计台成了ＰＣＲ突变引物,用于改造起始密码ＡＵＧ上下游序列,并在不改变５’端氨基酸编码的前提下,尽可能选用大肠杆菌高频使用的密码子。将经改造后的ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ和翻译起始区置于ＰＬ启动子之下,转入大肠杆菌Ｔａｐ１０６,经４２℃热诱导后,获得表达产物,提高表达水平近一倍,表达量达到菌体总蛋白量的３０％左右。表达产物经Ｗｅｓｔ     

人白细胞介素—2基因在人骨肉瘤细胞系内表达

从ｐＨＩＧ５３质粒内切下人白细胞介素－２ｃＤＮＡ基因,并经中间一ｐＳＰ７２转换成与ｐＤＯＲ－ｎｅｏ载体相区域的酶切位点,然后将ＩＬ－２ｃＤＮＡ定向连接入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ载体,构建成功人ＩＬ－２逆转录病毒载体,经脂质体民入人骨肉瘤细胞系Ｍａ中,经Ｇ４１８筛选后测转基因肿瘤细胞培养上清中ＩＬ－２表达量,每１×１０＾５细胞２４ｈＩＬ－２表达量为５０－８００Ｕ,为骨肉瘤的基因治疗创造条件。     

人白细胞介素—18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用反转录ＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）法从人肝组织中分离人白介素１８（ｈＩＬ１８）基因。克隆到Ｔｖｅｃｔｏｒｅａｓｙ载体中,经酶切初步鉴定后进行ＤＮＡ序列分析,结果表明与文献报道完全一致。以ｐＢＶ２２０为表达载体,在大肠杆菌中高效表达了ｈＩＬ１８基因,重组蛋白占菌体总蛋白的２７．２％。为进一步研究其生物活性奠定了重要基础。     

ras和c-erbB癌基因在特发性肺间质纤维化中的表达

采用原位分子杂交技术和免疫组织化学方法,对８例临床与肺组织学确诊的特发性肺间质纤维化（ＩＰＦ）病人的肺活检组织及７例正常肺组织进行了ｒａｓ和ｃ－ｅｒｂＢ癌基因及其产物的检测。结果：ｒａｓ癌基因产物Ｐ２１在６／８例ＩＰＦ肺组织中呈阳性反应;５／８例ＩＰＦ肺组织ｃ－ｅｒｂＢ－２显免疫阳性反应,而在７例正常肺组织Ｐ２１及ｃ－ｅｒｂＢ－２均无明显表达,原位杂交结果显示ＩＰＦ肺组织没有明显ｒａｓ和ｃ－ｅｒｂＢ癌基因的ＤＮＡ扩增提示ＩＰＦ的病变过程与ｒａｓ和ｃ－ｅｒｂＢ癌蛋白表达增强有关     

补调连蛋白

１９８６年,德国ＢｅｒｎｂａｒｄＮｏｃｈｔ热带医学研究所的Ｋｒｉｓｔｉｎｅ等在克隆补体调节蛋白Ｈ因子的ｃＤＮＡ时,首次从人肝ｃＤＮＡ里分离了克隆ＣＨＨ１７／ｐＦＨ１．８,其５′端序列１４０８ｂｐ与Ｈ因子５′端序列完全相同,并且其编码的蛋白质一级结构含...     

T细胞中IL-3基因表达调节的转录因子初探

主要利用凝胶迁移率试验和抗体超迁移试验,以ｈＩＬ－３基因５′侧翼含κＢ位点的序列为探针,探究ＮＦ－κＢ是否参与了ｈＩＬ－３基因的表达调节．结果表明,在Ｊｕｒｋａｔ细胞和人外周血Ｔ淋巴细胞中,都存在与此序列特异结合的可诱导蛋白;ＮＦ－κＢｐ６５亚基的单抗对ＤＮＡ－蛋白复合物的形成没有影响．这些结果揭示：正常细胞和肿瘤细胞中,确存在可特异识别ｈＩＬ－３基因５′侧翼的κＢ顺序的蛋白因子,而且该蛋白因子的表达是可诱导的;但ＮＦ－κＢ并未参与ＩＬ－３基因的表达调节．     

大鼠催乳素基因真核细胞可表达性质粒的构建及应用研究

７３５ｂｐ的ＰＲＬｃＤＮＡ片段从质粒ＰＲＬ－ＳＰ６５＃１中回收后,用粘性末端连接法将其重组到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,筛选出正向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ和反向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＡＳ。将重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬｓ和空载体ｐｃＤＮＡ３分别转入ＮＩＨ３Ｔ３细胞系,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞后与未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２的情况下,用原位杂交的方法,分别用ＰＲＬｃＤＮＡ探针和原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓｃＤＮＡ探针进行检测,未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２时都几乎无催乳素基因的表达,同样,转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞也无ＰＲＬ的表达,而转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ的ＮＩＨ３Ｔ３细胞则有大量的ＰＲＬ基因的表达,与对照组相比有显著差异（Ｐ＜０．０１）。正常和转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞有一定程度的原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓ的表达,当分别加入Ｅ２和转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ后,ＮＩＨ３Ｔ３细胞中的ｃ－Ｈ－ｒａｓ基因表达水平都显著升高（Ｐ＜０．０５）。     

人过敏毒素C5a反义cDNA的克隆、表达和拮抗作用

采用引物二聚体配对搭桥法成功扩增了人过敏毒素C5a全长的反义cNDA ,将扩增的反义cNDA克隆到原核表达载体pPROEXTM HTc上 ,与 6×His头形成融合基因 ,转化E .coliDH5α ,30℃下经IPTG诱导 ,该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ,表达量达 10 % ;利用金属螯合亲和层析一步法纯化 ,得到纯度 80 %的融合蛋白 ;烟草蚀刻病毒蛋白酶酶切超滤浓缩后 ,得到高浓度高纯度人过敏毒素C5a反义肽 ,经N端蛋白测序鉴定 ,其氨基酸序列正确 .髓过氧化物酶 (myeloperoxi dase ,MPO)为单核细胞PMN所特有 ,其活性可以间接反映C5a趋化白细胞的能力 ,C5a刺激血管内皮细胞表达胞间粘附分子 (ICAM 1)、血管间粘附分子 (PCAM 1)等 ,后者能增加对PMN的粘附 ,检测MPO活性可间接反映出C5a的功能 .还观察了纯化的C5a反义肽对C5a刺激内皮细胞胞浆[Ca2 + ]浓度变化的影响 .高浓度高纯度的C5a反义肽对C5a过敏毒素存在拮抗作用 ,说明反义肽在补体系统C5a分子中是存在的 .这为深入研究C5a反义肽的结构与功能关系提供了物质保证     

斜纹夜蛾GST基因的原核表达载体构建、融合蛋白表达及Northern印迹分析

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是生物体内重要的解毒酶系之一。根据斜纹夜蛾(Spodoptera litura)GST基因设计特异引物,从cDNA文库中扩增GST基因并克隆至pGEM-T载体,经鉴定后经SpeⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与表达载体pPROEX HTb连接,转化感受态细胞E.coliDH5α,经PCR鉴定和双酶切鉴定得到阳性重组质粒pPROEX HTb-GST,在IPTG诱导下,获得融合蛋白的表达。经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为25KD的GST融合蛋白。Northern杂交结果表明,2龄期斜纹夜蛾GST基因在mRNA水平上的表达量最大,3龄期次之,5龄期时的表达量最小。     

凋亡抑制因子Survivin在大肠杆菌TB1中的表达纯化及鉴定

 本文旨在克隆凋亡抑制因子Survivin基因,并在大肠杆菌中进行可溶性表达与初步纯化. 采用RT-PCR法,扩增人凋亡抑制因子survivin cDNA,并克隆入原核表达载体pMAL p2X中,转化TB1大肠杆菌感受态细胞.经0.3 mmol/L IPTG诱导2 h后,收集菌体蛋白,进行SDS-PAGE、ELISA及Western 印迹鉴定. 实验获得凋亡抑制因子survivin编码区cDNA,以构建的原核表达载体pMAL-p2X survivin转化菌株后,可表达凋亡抑制因子survivin和麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,相对分子质量(Mr) 为58 000.并成功利用Factor Xa将融合蛋白裂解开.ELISA和Western 印迹表明,融合蛋白能与抗凋亡抑制因子survivin单克隆抗体特异性结合.获得的凋亡抑制因子survivin全长cDNA可在大肠杆菌TB1中以MBP survivin融合蛋白的形式表达,成功地将survivin目的蛋白和MBP蛋白分离,为深入研究survivin的结构和功能奠定了基础.     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构3区基因片段的克隆表达及抗原纯化鉴定

通过逆转录ＰＣＲ技术,从中国江苏省丙型肝炎病人血清中扩增克隆了丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的非结构３区的部分基因片段（Ｃ３３）。ＤＮＡ序列分析证实,该片段全长８４２ｂｐ。在合成的一对逆转录ＰＣＲ引物上,上游引物增加了ＮｃｏⅠ酶切位点（内含起始密码子ＡＴＧ）,下游引物上增加了ＳａｌⅠ酶切位点及终止密码子ＴＡＡ,将克隆的Ｃ３３基因片段克隆至表达载体ｐＢＶ２２１内,获得了表达Ｃ３３抗原的工程菌,表达Ｃ３３抗原分子过为３０ｋＤ,经尿素裂解纯化、分子筛分离纯化及复性后进行离子交换和反相亲和层析纯化,获得的重组蛋白经ＥＬＢＡ和免疫印迹等证实有较好的抗原性和特异性。     

Polypeptide chain elongation factor 1 alpha (EF-1 alpha) from yeast: nucleotide sequence of one of the two genes for EF-1 alpha from Saccharomyces cerevisiae.

Messenger RNA for yeast cytosolic polypeptide chain elongation factor 1 alpha (EF-1 alpha) was partially purified from Saccharomyces cerevisiae. Double-stranded complementary DNA (cDNA) was synthesized and cloned in Escherichia coli with pBR327 as a vector. Recombinant plasmid carrying yEF-1 alpha cDNA was identified by cross-hybridization with the E. coli tufB gene and the yeast mitochondrial EF-Tu gene (tufM) under non-stringent conditions. A yeast gene library was then screened with the EF-1 alpha cDNA and several clones containing the chromosomal gene for EF-1 alpha were isolated. Restriction analysis of DNA fragments of these clones as well as the Southern hybridization of yeast genomic DNA with labelled EF-1 alpha cDNA indicated that there are two EF-1 alpha genes in S. cerevisiae. The nucleotide sequence of one of the two EF-1 alpha genes (designated as EF1 alpha A) was established together with its 5'- and 3'-flanking sequences. The sequence contained 1374 nucleotides coding for a protein of 458 amino acids with a calculated mol. wt. of 50 300. The derived amino acid sequence showed homologies of 31% and 32% with yeast mitochondrial EF-Tu and E. coli EF-Tu, respectively.     

里氏木霉纤维二糖酶bglII基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达*

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行 RT-PCR合成约1.4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型表达载体pJW2中,经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子,温度诱导后,经酶活测定,bgl II基因在大肠杆菌中得到了表达,酶活为0.75IU/mL。     

里氏木霉纤维二糖酶bgl II基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行 RT-PCR合成约1.4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型表达载体pJW2中,经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子,温度诱导后,经酶活测定,bgl II基因在大肠杆菌中得到了表达,酶活为0.75IU/mL.     

新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因的克隆和抗冻活性分析

根据GenBank中已发表的昆虫抗冻蛋白基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术结合3'-RACE扩增的方法,从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲 Microdera punctipenis dzunarica中获得了长约294 bp不含信号肽的抗冻蛋白cDNA片段,命名为MpAFP5,其全长序列为363 bp(GenBank注册号为：AY821792)。基因测序结果表明, MpAFP5-cDNA片段与加拿大拟步甲Dendroides canadensis AFP 8基因片段、黄粉甲Tenebrio molitor THP 4-9基因片段的核苷酸同源性分别达68.4%和71.8%,氨基酸序列同源性分别达70%和81%。将MpAFP5构建到原核表达载体pGEX4T-1中,重组质粒pGEX4T-1-MpAFP5在大肠杆菌BL21(DE3)中能够表达融合抗冻蛋白,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约为37 kD,Western印迹分析证明MpAFP5在大肠杆菌中正确表达。细菌的抗冻实验结果显示准噶尔小胸鳖甲融合抗冻蛋白对细菌具有显著的抗冻保护作用,保护效果与抗冻蛋白剂量呈正相关性。