鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用

根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a( )的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以109PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果。     

嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性分析

根据嗜水气单胞菌溶血素保护性抗原基因序列(GenBank Accession No. AF539467)设计一对引物, 以嗜水气单胞菌河北分离株基因组为模板, 经PCR扩增得到hly基因。序列分析表明, 该基因产物大小为1485 bp, 经测序与GenBank报道的多个嗜水气单胞菌hly基因序列一致性高于99%。将得到的hly基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中构建原核重组质粒pET-28a- hly, 转化大肠杆菌 BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-hly), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析可见一条56 kD的特异条带。Western blotting分析结果显示表达的Hly蛋白能与抗体发生特异性结合,说明其具有较好的免疫原性。将表达的溶血素蛋白制成类毒素疫苗免疫小鼠后, 具有较高的保护效力, 表明该类毒素疫苗有望作为预防由嗜水气单胞菌引起疾病的基因工程类毒素疫苗。     

腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究

根据GenBank公布的腐败梭菌α毒素基因序列,设计了一对引物,并以腐败梭菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出腐败梭菌菌株HeB01的α毒素基因。序列分析表明,该基因产物大小为1323bp,与GenBank报道的4个腐败梭菌参考菌株α毒素基因序列同源性高于99·5%。将扩增的α毒素基因定向克隆到原核表达载体pQE30中,得到重组质粒pQE30-α,将重组质粒转化大肠杆菌M15中,得到重组菌株M15(pQE30-α),经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见表达的48kD特异条带;Westernblot和ELISA检测实验表明:表达的α毒素与抗天然α毒素抗体发生特异性反应,说明α毒素蛋白具有较好的免疫原性。将表达的α毒素蛋白制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护能力,表明该重组菌株有望作为腐败梭菌基因工程类毒素疫苗的候选生产菌株。     

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用

根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以10⁹PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果     

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用

根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以10⁹PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果     

表达ST1-LTB-a-b融合蛋白基因工程菌株的构建及其免疫原性分析

采用分子生物学技术构建了含有ST1-LTB-a-b融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pETST3LTBab), SDS-PAGE和 Western blotting分析表明ST1-LTB-a-b融合基因在大肠杆菌中得到了高效表达, 融合蛋白分子量约为110 kD; 20 L发酵罐培养得到的最佳诱导条件为: 重组菌株以1%接种量、5 L/min通气量培养3 h后加终浓度为0.03 mol/L的乳糖诱导, 通气量升至12.5 L/min继续培养6 h, 表达量占菌体总蛋白的38.53%; 表达的ST1-LTB-a-b融合蛋白无毒性但具有免疫原性, 可以抵抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的感染; 构建的重组菌株BL21(DE3)(pETST3LTBab)有望作为预防仔猪腹泻基因工程疫苗的候选生产菌株。     

米根霉菌ldhL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以米根霉菌基因组DNA为模板,根据GenBank上已公布的米根霉L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)序列设计特异性引物,PCR扩增得到963 bp的DNA片段,经序列分析后将其亚克隆到原核表达载体pET30a上,构建成重组质粒pET30a-ldhL.将pET30a-ldhL转化到BL21感受态细菌中,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,可见约43 kD的与预期大小一致的目的蛋白条带,结果表明ldhL基因在大肠杆菌中进行了表达,经酶活分析产物的酶活力为98 U/mL,证明了表达产物具有预期的酶活性,这为进一步研究利用乳清为发酵原料高产L-乳酸的米根霉基因工程菌株奠定了基础.     

罗尼氏弧菌Vibrio shilonii BY新琼胶酶基因的克隆、序列分析及表达

【目的】从海洋来源的罗尼氏弧菌菌株BY中克隆得到一个具有琼胶酶活性的新基因,并对其进行重组表达。【方法】对实验室保藏的产琼胶酶菌株BY进行16S rRNA基因序列分析,并构建系统发育树。根据已报道的琼胶酶基因序列的同源性,设计简并引物,利用降落PCR (Touch-down PCR)及染色体步移技术扩增琼胶酶基因序列全长,对基因序列进行生物信息学分析。将目的基因插入pET22a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),对重组酶进行表达,利用DNS法测定了重组酶的酶活,对该重组琼胶酶酶学性质进行研究。【结果】克隆得到一条新的琼胶酶基因,命名为Vibrio sp. BY (GenBank登录号：AIW39921.1),Vibrio sp. BY基因序列全长2 232 bp,编码744个氨基酸,理论分子量为85 kD,Vibrio sp. BY的氨基酸序列基因库中与已知的琼胶酶氨基酸序列Vibrio sp. EJY3的相似度为86%。发酵液琼胶酶酶活力为71.73 U/mL,证明表达的蛋白为琼胶酶。酶学性质研究表明重组琼胶酶的最适温度及pH分别为50 °C和7.0,并且具有较好的稳定性。【结论】利用染色体步移技术克隆得到一条新的琼胶酶基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了重组表达,为琼胶酶的应用奠定了基础。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamHI和EcoRI位点,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达,SDS－PAGE蛋白电泳表明在39．9kD处出现超强特异带,占总蛋白的51％。以Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该39．9kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示,该抗体与表达的融合蛋白和从嗜水气单胞菌中提取的36．9kD外膜蛋白均呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性,为此融合蛋白作为 疫苗的候选成份提供理论基础。     

停乳链球菌isp基因的克隆与原核表达

根据GenBank报道的停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)isp基因(GenBank:CP002215.1)序列设计引物,PCR扩增得到isp基因。片段大小为1 500 bp,与从GenBank下载的序列进行同源性比对结果为98.57%。将isp基因克隆于表达载体pET-25b,成功构建了重组质粒pET-25b-isp,将重组质粒分别转化BL21(DE3),将BL21(pET-25b-isp)阳性重组菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果显示均有蛋白表达,大小分别为53 ku与目的蛋白大小相符;Western blot检测显示,表达的蛋白为目的蛋白。对成功构建的菌株BL21(pET-25b-isp)表达条件经优化后,在温度37℃,诱导时间12 h,IPTG浓度为1 mmol/L时,蛋白有较高的表达量。     

狂犬病病毒糖蛋白在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的表达狂犬病病毒糖蛋白（GP）,用于狂犬病疫苗免疫抗体评估和狂犬病病毒糖蛋白功能的研究。方法采用分析软件,分析其可能的抗原表位,利用PCR方法扩增狂犬病病毒SRV9疫苗株G蛋白抗原位点区域基因,PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后,插入大肠埃希菌表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的蛋白,进行SDS-PAGE分析。表达蛋白进行电洗脱纯化和Western blot鉴定分析。结果成功构建了pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a表达质粒,序列分析表明,插入片段大小分别为1314 bp和1275 bp。SDS-PAGE分析结果证明,在大肠埃希菌系统中成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达的融合蛋白含有GST标签,大小分别约为74×103和73×103。Western blot鉴定结果表明,表达产物有抗原特异性并能与狂犬病病毒抗血清反应。结论利用大肠埃希菌表达系统成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达产物有良好的反应原性。     

假单胞菌海因酶基因在大肠杆菌中的高效表达(英文)

为实现利用生物酶转化法进行D 对羟基苯甘氨酸的工业化生产 ,构建了 3株海因酶基因工程菌 .利用PCR技术从恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida)CPU 980 1染色体DNA中扩增得到长约1.8kb的含编码区和自身启动子的海因酶全基因 .通过将海因酶全基因插入pMD18 T质粒、海因酶基因的编码区与pET 17 b质粒重组、海因酶基因编码区和T7强启动子一起插入pMD18 T质粒分别得到重组质粒pMD dht、pET dht和pMD T7 dht.将上述重组质粒分别转化大肠杆菌 (Escherichiacoli) ,通过地高辛标记菌落原位杂交和海因酶活力测定两种方法 ,筛选出具有海因酶活力的阳性转化子 .结果表明 ,大肠杆菌的RNA聚合酶能够识别和结合来自恶臭假单胞菌海因酶基因的自身启动子 ,该启动子在大肠杆菌中能够工作 .基因工程菌E .coliBL2 1 pMD dht、E .coliBL2 1 pET dht和E .coliBL2 1 pMD T7 dht的海因酶活力分别为 170 0U L、190 0U L和 2 5 0 0U L ,比野生菌P .putidaCPU 980 1的海因酶活力分别提高了 8倍、9倍和 12倍 .薄层扫描结果显示 ,这些工程菌的海因酶表达量分别约占菌体总可溶性蛋白质的 2 0 %、31%和 5 7%.SDS PAGE显示 ,海因酶的单体分子量约为 5 0kD .经工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht催化 ,底物对羟基苯海因的转化率在 13h内可达到 9     

嗜水气单胞菌TPS-30株丝氨酸蛋白酶基因与溶血素基因在大肠杆菌中的融合表达

嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶和溶血素是该菌重要的致病因子与保护性抗原。致病性嗜水气单胞菌TPS-30株为江浙一带鱼类暴发病病原主要血清型O:9的代表株。研究利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌TPS-30株的丝氨酸蛋白酶基因(Spe)和溶血素基因(Hly),将基因Spe和Hly通过柔性片段进行融合,并将融合片段插入pET32a的多克隆位点,构建成重组融合表达载体pET32a-Spe-Hly。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得融合蛋白Spe-Hly。表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期大小约130kD相吻合的融合蛋白带。纯化融合蛋白并对鲫鱼进行免疫攻毒试验。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因和溶血素基因融合表达载体构建成功,并成功获得了融合蛋白Spe-Hly,对鲫鱼的免疫保护率达81.4%。这为基因工程亚单位多价疫苗的开发提供基础。       

狂犬病病毒N蛋白主要抗原区的表达及SPA-ELISA抗体检测方法的建立

为有效监测免疫狂犬病疫苗后的抗体水平,以狂犬病病毒N蛋白的主要抗原表位所在区域N1蛋白为包被抗原,建立了SPA-ELISA抗体检测方法。用RT-PCR方法分别扩增出狂犬病病毒Flury LEP株N基因及其N1区域 (1 000~1 353 bp),将二者分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,并将重组的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3) 中,经1 mmol/L IPTG诱导后进行免疫印迹分析。结果表明,重组的RV N和RV N1均以包涵体形式表达。与表达全长RV N相比,RV N1的表达量显著高于前者,且该重组蛋白同样具有良好的反应原性。用纯化的重组RV N1作为诊断抗原建立了检测犬RV抗体的间接ELISA方法。通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量是2 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,Protein A-HRP的稀释度为1∶4 000。用建立的ELISA方法对102份临床血清样品进行检测,与商品化试剂盒相比,二者的符合率为94.1％。试验结果表明基于主要抗原表位所在区域N1蛋白的SPA-ELISA方法可有效用于犬RV抗体水平的检测,为检测RV免疫抗体的ELISA试剂盒的研制奠定了基础。     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST1-LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、LTB和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实,表达的融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。免疫实验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄、白痢基因工程菌苗的候选菌株。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA和EspB蛋白的重组表达及其免疫效果

目的：通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7的EspA和EspB蛋白,并分析它们的免疫保护性。方法：采用PCR技术从EHEC0157：H7基因组中扩增espA和espB基因,连接至pET-22b（4-）载体上,转化至宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,用亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量,免疫小鼠分析其免疫保护性。结果：重组espA和espB基因片段的测序结果与GenBank中的相应基因序列完全一致,一致性均为100％;得到了纯度为95％以上的重组EspA和EspB蛋白,免疫小鼠所得到的抗体效价均为10^6。结论：重组EspA和EspB蛋白获得了可溶性表达,表达的蛋白具有良好的免疫保护性,为进一步制备疫苗奠定了基础。     

A high-throughput comparison of recombinant gene expression parameters for E. coli-mediated gene transfer to P388D1 macrophage cells

Escherichia coli strain BL21(DE3) was tested as a delivery vector for gene transfer to a murine P388D1 macrophage cell line using a 96-well high-throughput assay. Five recombinant strains of E. coli were compared to identify the effect recombinant listeriolysin O (LLO) and associated gene expression parameters had on final delivery of a luciferase reporter gene. Listeriolysin O, native to Listeria monocytogenes and used here in an effort to improve final gene delivery, was expressed from plasmid and chromosomal locations under the control of constitutive Tet or inducible T7 promoters. The E. coli vectors delivered the luciferase reporter gene to the P388D1 line with success assessed by recording luciferase luminescence activity within the macrophage cells. The assay allowed rapid analysis and evaluation of each E. coli strain tested with strain BL21(DE3) harboring a chromosomal copy of the T7-driven LLO gene showing the greatest relative measure of gene delivery. Strains were separately assayed for LLO activity and exhibited a trend of maximum gene delivery between the lowest and highest recorded LLO activities.