基于受激发射损耗显微术的活细胞和活体超分辨成像

细胞作为生命体基本的结构和功能单元，在生物、医学等领域有着非常重要的研究意义。随着现代科学和技术的发展，科学家们借助电镜对细胞以及细胞器的空间结构已经有非常清晰的认识，但是对它们的功能以及细胞之间的相互作用却了解得非常少，而这恰恰又是疾病治疗和药物开发亟需了解的信息，因此对离体活细胞（简称活细胞）和活体生物组织细胞（简称活体细胞）中亚细胞器的研究变得非常重要。然而细胞中许多细胞器的结构在纳米量级，传统的光学成像技术由于受到光学衍射极限的限制是无法观察到纳米量级的生物结构，因此光学超分辨成像技术是目前研究亚细胞器结构和功能的有效工具。在所有光学超分辨显微技术中，受激发射损耗显微术（stimulated emission depletionmicroscopy,STED）由于具有实时成像、三维超分辨和断层成像的能力，非常适合用于纳米尺度的活细胞和活体细胞成像研究，而且STED超分辨成像技术经过近几十年的发展，已经广泛用于活细胞甚至活体小鼠细胞的超分辨动态观测。本文总结了近年来活细胞和活体小鼠神经元细胞等领域STED超分辨成像的研究进展，介绍了用于活细胞和活体细胞STED超分辨成像的荧光染料...     

STORM和STED显微成像技术特点的比较

随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)技术和受激发射损耗(stimulated emission depletion,STED)显微镜技术是近年来发展迅速的两种超分辨率荧光显微镜技术。这两种技术均提供超越传统荧光显微镜分辨率成像的功能,具有多色显像,三维成像以及活细胞内成像的潜力。在这篇综述中,我们关注两种技术荧光控制、激光强度等技术参数设定,同时结合样品制备、图像采集与处理等流程优化对比两者在分辨率、图像采集时间及具体应用中的优劣。STORM可获得更高的三维分辨率,但可能需要更长的图像采集时间。STED需要较高损耗光强度,却能在图像采集后立即生成超分辨率图像,不需要额外图像数据处理。最终,选择STORM和STED不仅取决于技术的具体应用,还取决于操作者优化各环节技术参数的能力,从而决定图像质量。     

膨胀显微成像技术的原理及应用

膨胀显微成像技术（expansion microscopy,ExM）是一种新型超分辨成像技术。该技术借助可膨胀水凝胶均匀地物理放大生物样本,在常规光学成像条件下实现超分辨成像。ExM适用于细胞、组织切片等多种类型生物样本。蛋白质、核酸、脂质等生物大分子均可借助ExM进行超分辨成像。ExM可与共聚焦显微镜、光片显微镜、超高分辨显微镜联合使用,进一步提高成像分辨率。近年来,多种从基础ExM拓展而来的衍生技术进一步促进了该技术的实际应用。本文综述了ExM及其衍生技术的基本原理、ExM与不同成像技术联用的研究进展及ExM在不同类型生物样本中的应用进展,并对ExM技术的发展前景做出展望。     

多光子显微成像技术在脑部疾病研究中的应用

由于多光子显微技术具有高时空分辨率、低损伤性、可对活体长时间成像等特点,近年来已被广泛应用于生物医学等领域,并且在多种疾病诊断中展现出巨大的应用潜力.尤其是在脑部疾病的研究中,利用多光子成像技术可实现对复杂神经网络的研究,包括对脑部神经细胞、血管、肿瘤等进行实时成像并研究各自之间的相互作用,能进一步揭示脑疾病的发病机制并指导检测治疗方法的开发.本文简要介绍了多光子成像技术的基本原理及特点,总结了其在阿尔茨海默病、脑中风、脑肿瘤等多种脑部疾病中的应用,详细阐述了近年来利用多光子成像技术在脑部疾病研究中所获得的成果,并对多光子成像技术的发展前景进行了展望,预期其在脑部疾病的研究中将发挥更大的作用.     

电子断层成像技术及其在细胞生物学中的应用

电子断层成像技术（electrontomography）是近年来发展起来一项三维成像技术,可以在纳米分辨率（2-10nm）水平上获得生物大分子及其复合物或聚集体、细胞器、细胞以及组织的三维结构,而且可以用于研究生物大分子在细胞中的定位、排列、分布以及相互作用,已逐渐成为细胞生物学领域中的一项重要技术手段。该文针对这项技术及其在细胞生物学中的应用作一简要介绍。     

三套荧光显微成像系统在光敏剂亚细胞定位研究中的应用比较

目的：对三套荧光显微成像系统在国产新型光敏剂HMME亚细胞定位研究中的应用特点及适用范围进行了比较与评价。方法：分别应用LSCM、CCD、ICCD荧光显微成像系统,选择特异性细胞器荧光探针Rhodamine-123、DIOC6(3)标记细胞内线粒体和内质网。采用细胞器-细胞荧光强度比值法,对HMME进行单细胞内分布的定性与定量研究。结果：LSCM和CCD成像系统能采集到浓度达到160μg／ml时的HMME的荧光图像,获得荧光探针图像信息显示所标记的细胞内线粒体和内质网平均荧光强度比值(J1/J2值)都明显高于细胞内J1/J2值。而ICCD成像系统只需HMME浓度为5μg/ml,荧光图像特点都呈胞浆中荧光强度较高且分布不均,细胞核区荧光较弱的中空现象。ICCD系统对细胞器探针荧光图像在空间分辨上不理想。结论：LSCM与CCD成像系统限于其探测灵敏度,对于弱荧光性光敏剂,适用于其高孵育浓度条件下的亚细胞定位研究。二者获得的结果相一致：孵育24h,HMME在鼠肺内皮细胞线粒体和内质网有分布而几乎不进入细胞核。ICCD成像系统可不受孵育浓度条件的限制,实现光敏剂极微弱荧光的有效探测,但空间分辨率较低。     

活细胞RNA动态成像技术进展

RNA是生命“中心法则”的主要成员,广泛参与细胞内各种生命活动. RNA在活细胞内的区室定位和动态过程与RNA功能息息相关.因此,需要开发活细胞内RNA成像技术,追踪RNA时空动态过程,原位阐明RNA活性和功能,进一步解析RNA相关生命过程和疾病的关系.本文系统阐述两大活细胞RNA成像体系:(i)RNA发夹:荧光蛋白体系;(ii)荧光响应RNA适配体:小分子探针体系.并介绍其他可用于动态示踪RNA的技术,概述不同技术在追踪活细胞RNA方面的特点和问题,讨论RNA动态成像技术未来的发展方向.     

生物单分子探测与成像的新进展

生物单分子研究是分子生物学向更深层次发展的自然趋势。从上世纪末开始,由于研究单分子技术的不断发展,这一领域已取得了许多重要成果。近年来活细胞内单分子过程的揭示成为关注的焦点。丈章仅从基因表达的研究、用受激发射损耗（STED）成像研究细胞膜、胞浆中单个分子的追踪以及单分子力谱在细胞生物学中的应用等几个方面说明本领域发展的现状。     

原子力显微技术成像在生物医学中的应用

原子力显微技术利用探针尖端与标本之间相互作用的力场对标本进行三维成像。这种成像可在生理条件下进行 ,可进行动态观察和标本容易制备是有别于其它成像技术如电子显微镜成像等的特点。对于细胞和生物大分子 ,能够在生理条件下成像具有重要意义。它意味着人们在认识生命本质的方法学方面 ,又向前迈出了新的一步。本文简要综述对细胞和生物大分子的成像在生物医学方面的应用。     

荧光显微术在当代植物细胞生物学研究中的应用

自从八十年前第一次在显微镜下观察到生物组织经紫外线照射后发射荧光的现象以来,荧光显微术不断获得进步,现已发展成细胞生物学中一个重要的研究手段。高度的灵敏性和专一性、制样与观察程序的简便、尤其是适宜于活细胞研究等特点,是它所具有的独特长处。荧光显微术特别是免疫荧光技术在现代医学生物学研究中的应用是一个     

超高分辨率显微镜推进纳米生物学研究

超高分辨率显微镜是近年来生命科学领域重要的研究手段之一。2014年诺贝尔化学奖颁发给超高分辨率显微技术领域的三位科学家,以表彰他们在该领域所作出的杰出贡献。超高分辨率技术的典型代表有受激损耗、结构光照明以及单分子定位等。这些技术的出现使得传统光学显微镜难以分辨的细胞器、分子等细节信息可以被观察到,帮助科学家从纳米尺度认识细胞内分子结构、定位以及相互作用。     

几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展

在生命科学领域,人们常常需要在细胞内精确定位特定的蛋白质以研究其位置与功能的关系．多年来,宽场/共聚焦荧光显微镜的分辨率受限于光的阿贝/瑞利极限,不能分辨出200 nm以下的结构．近年来,随着新的荧光探针和成像理论的出现,研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率的三维超分辨率成像方法．主要介绍这些方法的原理、近期进展和发展趋势．介绍了光源的点扩散函数(point spread function, PSF)的概念和传统分辨率的定义,阐述了提高xy平面分辨率的方法．通过介绍单分子荧光成像技术,引入了单分子成像定位精度的概念,介绍了基于单分子成像的超分辨率显微成像方法,包括光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy, PALM)和随机光学重构显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)．介绍了两大类通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率的方法,分别是受激发射损耗显微技术(stimulated emission depletion, STED)和饱和结构照明显微技术(saturated structure illumination microscopy, SSIM)．比较了不同的z轴提取信息的方法,并阐述了这些方法与xy平面上的超分辨率显微成像技术相结合所得到的各种三维超分辨率显微成像技术的优劣．探讨了目前超分辨率显微成像的发展极限和方向．     

受激发射损耗显微术(STED)的机理及进展研究

由于光学元件的衍射效应,常规光学显微术的分辨率被限制在半波长左右,无法满足对于亚百纳米尺度的样品进行探测的需求。受激发射损耗显微术(STED)通过引入一束损耗光以受激发射的方式减小有效荧光的发光面积,可以实现超衍射极限的空间分辨率。自提出以来,STED显微术经过了多方面的改进和发展,已被成功地应用于生物医学、材料学等领域,对样品进行多功能超分辨成像。本文详细阐述了STED的机理及其中的关键技术,综述了STED的发展历程及最新进展,并介绍了其具体应用。     

Super-resolution imaging reveals cytoskeleton-dependent organelle rearrangement within platelets at intermediate stages of maturation

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Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope’s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.     

Super-resolution Microscopy Reveals Compartmentalization of Peroxisomal Membrane Proteins

Membrane-associated events during peroxisomal protein import processes play an essential role in peroxisome functionality. Many details of these processes are not known due to missing spatial resolution of technologies capable of investigating peroxisomes directly in the cell. Here, we present the use of super-resolution optical stimulated emission depletion microscopy to investigate with sub-60-nm resolution the heterogeneous spatial organization of the peroxisomal proteins PEX5, PEX14, and PEX11 around actively importing peroxisomes, showing distinct differences between these peroxins. Moreover, imported protein sterol carrier protein 2 (SCP2) occupies only a subregion of larger peroxisomes, highlighting the heterogeneous distribution of proteins even within the peroxisome. Finally, our data reveal subpopulations of peroxisomes showing only weak colocalization between PEX14 and PEX5 or PEX11 but at the same time a clear compartmentalized organization. This compartmentalization, which was less evident in cases of strong colocalization, indicates dynamic protein reorganization linked to changes occurring in the peroxisomes. Through the use of multicolor stimulated emission depletion microscopy, we have been able to characterize peroxisomes and their constituents to a yet unseen level of detail while maintaining a highly statistical approach, paving the way for equally complex biological studies in the future.     

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type¹. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines². Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism^3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation⁴. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines^5,6,7. A link between IL-1β release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes⁸. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.