枯草杆菌(Bacillus subtilis)产果胶酶的研究Ⅰ.菌种选育、鉴定及其酶学特征分析

分离到1株高产果胶酶菌株,经形态、生理以及生化指标鉴定,确认为枯草杆菌(Bacillus subtilis)并命名为枯草杆菌18.发酵液用90%硫酸铵沉淀,透析后的粗酶经CM-52柱层析,收集酶峰,再过Shephadex G-100得部分纯化酶.该酶最适pH9.0,在pH9～11稳定,最适反应温度60℃,50℃加热50 min保存60%酶活,60℃加热50 min酶活则保存10%.酶的等电点(pI)4.0,分子量31 000.该酶对苎麻脱胶有较好的特异性.     

产蛋白酶枯草杆菌的选育及应用研究——Ⅰ.菌种筛选及产酶条件初步试

从沟泥等土样中分离筛选到四株蛋白酶高产菌株,进行了产酶条件复筛试验,其中枯草杆菌N1025在45℃摇瓶培养24小时酶活可达3400u/ml,该酶具有良好的脱丝胶性能。此菌培养温度高,生长周期短,具有较大的生产潜力。     

海洋扩展青霉（Penicillium expansum）果胶酶的纯化及酶学性质研究

通过超滤、DEAE Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析,对一株来自海洋的扩展青霉(Penicillium expansum)所产果胶酶进行分离纯化,得到电泳纯的果胶酶,经SDS-PAGE电泳显示单一条带,且果胶酶亚基的分子质量约为63.96 ku,纯化倍数为24.13,回收率为36.32%。酶学性质研究结果表明,该果胶酶的最适反应温度为50℃,最适p H值5.4,在p H值4.6~6.2比较稳定,Mg2+、Ca2+对果胶酶活力有明显激活作用,Cu2+有明显抑制作用,以果胶粉为底物的Vmax为393.56μg/(min·m L),Km为3.34 mg/m L。     

重组枯草杆菌纤溶酶的酶学性质研究

对一种重组枯草杆菌纤溶酶 (rBSFE)的酶学性质进行了初步研究 ,结果表明 :酶作用最适温度为 35℃ ;最适反应pH为 8.0 ;酶活性能被PMSF抑制 ,是典型的丝氨酸蛋白酶。通过与尿激酶进行比较 ,发现该酶对纤维蛋白有直接降解作用 ,而对于纤维蛋白原的敏感性则低于尿激酶 ,提示该酶具有直接溶栓作用 ,又不致引起出血 ,是一种有潜力的新型溶栓剂。     

家蚕肠道枯草杆菌产蛋白酶的发酵条件与酶学性质

肠道微生物分泌的蛋白酶可促进家蚕对桑叶养分的消化吸收,枯草芽孢杆菌是家蚕肠道内一种重要的产蛋白酶菌株。为提高枯草芽孢杆菌蛋白酶的高效利用,对该菌株适宜发酵条件及酶学性质进行了研究。结果表明：各因素对枯草芽孢杆菌产酶活性影响的大小顺序依次为：pH值〉培养温度〉培养时间〉装液量;最适的产酶条件为：pH=7,培养温度：30 ℃,培养时间：36 h;对枯草芽孢杆菌产蛋白酶进行初步提纯后并研究得出该酶反应的最适pH 10.0,最适反应温度为：60 ℃;该酶为碱性蛋白酶、不耐高温、不耐酸,但在35 ℃条件下热稳定性较好。     

乙醇脱氢酶（ADH）产酶菌株的选育

从食醋生产企业的醋醅中采集样品,以乙醇为唯一碳源,用碳酸钙透明圈平板法分离出185株菌株,然后以产酸量和耐乙醇能力为标准,瓶发酵选育出20株ADH产酶菌株;A5-2产酸量为49.85 g/L,耐乙醇能力强,A5-2的菌种形态学和16S rDNA序列分析初步鉴定为巴斯德醋酸杆菌（ Acetobacter pasteurianus）;A5-2乙醇脱氢酶酶学性质研究表明：最适作用温度和pH分别为45℃和pH 4.0,具有一定的耐热性和良好的耐酸碱性;A5-2乙醇脱氢酶粗酶制备条件为硫酸铵饱和度70%~80%,回收率84%。     

产有机相催化酯合成活性的脂肪酶菌株的筛选

通过添加10g/L的甲苯作为唯一碳源进行预培养,然后以透明圈平板筛选法从土壤样品中成功地筛选到了一株耐有机溶剂的产脂肪酶的酵母菌A213,初步鉴定为耶罗威亚酵母(Yarrowia sp．)。摇瓶实验表明,A213适宜的产酶培养基为(g/L):酵母膏40g,橄榄油10g,MgSO~4·7H~2O 1g,KH_2PO_45g,最佳培养条件为27℃、初始pH 6．5。脂肪酶活力最高可达67．8 IU/mL;该酶最适作用温度为40℃,最适作用pH为6．5,在70℃以下, pH 5．5～8．5范围内稳定,能直接在叔戊醇溶剂中催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯。     

草酸青霉液体发酵产果胶酶条件的优化及其产物的酶学性质

采用响应面分析法对草酸青霉（Penicillium oxalicum）L5菌株液体发酵产果胶酶条件进行了优化。结果表明：桔皮粉、米糠及硫酸铵的添加量分别为4.85%、5.89%、0.97%,摇瓶初始pH为6.0~8.0,接种量为9%时,优化后的果胶酶活达54 391.70 U,是初始酶活18 148.00 U的3倍。另外,对其果胶酶性质进行了初步探讨,结果表明：该酶较适反应温度和pH分别为50℃和5.0;30~50℃时有较好的热稳定性,pH值为5.0时稳定性最佳。     

枯草杆菌SOD高产菌株的诱变选育及产酶条件研究

本实验采用低能氮离子注入技术对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行辐照诱变处理,选育出一株SOD高产菌株(编号为BsB8)。其生物量略高于出发菌株、SOD产量达3439．3U／g湿菌体,为实验出发菌的1．88倍。该菌株最佳产酶条件为：起始pH为8．2,装液量为150ml／500ml,接种量为1．5％;添加Mn^2 的培养基可显著提高SOD酶活。     

高产碱性果胶酶菌株的育种及其发酵条件的研究

以克劳氏芽孢杆茵(Bacillus clausii)S-4为出发菌株,经紫外诱变育种和固态发酵条件的选育,得到产碱性果胶酶较高的新茵株N-10,并研究了其固态发酵条件和部分酶学性质.结果表明,以甜菜渣为碳源和酶的诱导物以及棉粕作为氮源较适宜.较优的固态发酵条件为:甜菜渣5g,棉粕0.125 g,麦芽糖0.1 g,KH2PO40.0075 g,Na2CO30.15 g,水12.5 mL,种龄24 h,接种量2mL,发酵温度40℃,发酵时间84 h;酶产率可达4780 u/g(干甜菜渣),较菌株S-4提高108%.该酶的最适pH 10,最适温度55℃;分别在pH 7.5～9.5和30～40℃范围内较稳定;Ca2 、Mg2 、Fe2 对酶活有明显激活作用,Cu2 、Zn2 对酶活有强烈抑制活作用.     

枯草杆菌及大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶的酶学性质研究

对枯草杆菌异柠檬酸脱氢酶（BsIDH）、大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶（EcIDH）和大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶的突变体酶（EmIDH）进行了纯化和酶学性质鉴定。BsIDH和EcIDH对辅酶NADP^＋的特异性与NAD^＋相比,分别是NAD^＋的1330倍和3890倍。而EmIDH对NAD^＋的特异性与NADP^＋相比,是NADP^＋的122倍。因此BsIDH和EcIDH是NADP^＋依赖性异柠檬酸脱氢酶,而EmIDH的辅酶特异性已转换为NAD^＋依赖性。EcIDH、BsIDH和EmIDH对底物异柠檬酸的Km值分别为67.4 μmol/L、60.6 μmol/L和105.6 μmol/L。BsIDH和EcIDH的最适反应pH分别为8.2和8.0,EmIDH的最适pH为7.0。BsIDH和EmIDH的最适反应温度是45℃,EcIDH的最适温度为43℃。三种IDH的活性依赖于不同的二价金属离子的存在,Mn^2＋ 、Mg^2＋存在时酶活性最强,Cu^2＋ 、Ca^2＋ 、Zn^2＋和Ni2＋强烈抑制酶的活性。系统的酶学性质研究为深入认识IDH的催化与调节机制提供了更多依据。     

一株产环糊精葡萄糖基转移酶的地衣芽孢杆菌的选育、产酶条件及酶学特性

从土壤分离物中筛选到一株环糊精葡萄糖基转移酶 (CGTase)产生菌 4 0 3,96h发酵酶活为 0 95U mL。经紫外辐射和硫酸二乙酯复合诱变而获得突变株CLS4 0 3,96h发酵酶活达 1 36U mL ,提高 4 3%。该突变菌株被鉴定为地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis) ,产CGTase的最佳碳源为可溶性淀粉 ,最佳氮源为硝酸铵 ,最适初始pH为 6 5 ,最适培养温度为 35℃ ,发酵期间CGTase的产生高峰 (第 96h)滞后于菌体生物量高峰 (第 4 8h) 2d。菌株所产CGTase的最适反应pH为 6 0 ,最适温度为 5 5℃ ,在pH 6 0～ 7 5间和 5 0℃下保持 1h后的剩余酶活均达 90 %以上 ;酶液中适量添加Ca2 能大幅提高CGTase在 5 5℃下的稳定性。经高效液相色谱分析 ,CGTase作用于淀粉后的产物以α 环糊精为主 ,β 环糊精为次 ,二者比例为 2 4 7∶1,环糊精总产率达 2 9 8% ,但产物中不含γ 环糊精     

芽孢杆菌（Bacillus sp.No.74）大麻脱胶酶系的研究

研究了Bacillussp.No．74菌株,在以玉米粉为碳源,硫酸铁为氮源,35℃,摇瓶培养24h。经测定产生的脱胶酶系有：果胶酶、木聚糖酶、CMC酶、蛋白酶和α－淀粉酶,不产生β－葡萄糖苷酶和C1酶。经底物亲和性试验和紫外分光光度计测定,证明产生的果胶酶为聚半乳糖醛酸裂解酶,其最适作用pH9．6,温度50℃。对温度的稳定性与它所处介质有极密切的关系。     

重组枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶的纯化和性质研究

大肠杆菌中表达的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶(5-aminolevulinate dehydratase, ALAD),其N端含有组氨酸标签,Ni-NTA 一步纯化至均一.纯化的酶比活为3.6 U/mg蛋白,酶的最适pH为8.0～10.0,Km为0.95 mmol,Vmax为16.7 mmol/h,在55 ℃温浴10 min,酶活保留85 %,2 mmol/L的K+、Zn2+、Mg2+、Li+、Fe3+和Mn2+提高酶活,2 mmol/L的Co2+和Ca2+对酶活没有显著影响,2 mmol/L的Cu2+和1 mmol/L的Hg2+完全抑制酶活.在2 mmol/L的EDTA存在下酶活性丧失,表明酶催化依赖金属离子.100 mmol/L的酮戊酸抑制酶活约50 %.10 mmol/L的2-巯基乙醇时提高酶活3倍,而100 mmol/L的二硫苏糖醇几乎完全抑制酶活.氨基酸修饰表明赖氨酸和半胱氨酸残基可能是酶催化必需的,组氨酸和丝氨酸残基对酶催化不起关键作用.     

研究型模块实验“产淀粉酶菌株的筛选、发酵条件优化、菌种鉴定和选育”的教学实践

采用模块化形式开展微生物学实验教学可提升学生的学习积极性,培养学生的探究性学习精神。"产淀粉酶菌株的筛选、发酵条件优化、菌种鉴定和选育"模块实验以产淀粉酶细菌为研究对象,安排学生开展培养基的配置、土壤样本采集和分离筛选产淀粉酶菌株、产淀粉酶菌株的发酵条件优化、菌种的形态学和分子生物学鉴定、紫外线诱变育种等5个单元实验。该模块实验以连贯性的研究任务引导学生进行探究性学习,将微生物实验操作技能的学习融合于探究性学习过程。实验以学生为主体,采用"固定+机动"方式安排教学任务,保证模块实验的整体性和连贯性。采用"模块论文+现场操作考试"的方式进行考核,提升学生的科研素养和强化学生对微生物基本操作技能的掌握。该研究型模块实验的教学提升了学生的微生物学研究热情,提高了微生物学课程群的教学质量。     

产蛋白酶枯草杆菌的选育及应用研究——Ⅱ.N1025菌产酶条件与酶性质的初步考察

本文报道产蛋白酶菌株枯草杆菌N1025的产酶条件及酶性质的初步考察。在45℃培养,最适产酶时间为20小时,培养基以自然pH为好,CaCl₂、MgSO₄、FeCl₃及CaCO₃有促进产酶作用,尿素、(NH₄)₂SO₄及NaNO₃对产酶有明显的抑制作用。以酪蛋白为底物,在45℃时,pH7—8酶活性较高;在52—55℃,出现pH 7及9两     

蛋壳内膜分解菌的筛选、鉴定及其所产蛋白酶性质的初步研究

从土壤中分离筛选到具有分解利用蛋壳内膜能力的菌株Pes207,通过生理生化鉴定及16S rRNA序列分析,确定其为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。通过分离纯化及初步酶学性质研究发现,该菌株所产胞外蛋白酶分子量约为32 ku,最适反应温度为60℃,最适pH为8.0,Km值为2.89 mmol/L。Pes207具有很强的分解液化蛋壳内膜的能力,其所产蛋白酶在pH 5.5～9.0、温度30～70℃之间具有良好的分解活性,具有较好的应用前景。     

一株产阿魏酸酯酶丝状真菌的分离鉴定及其粗酶性质研究

利用平板透明圈法,筛选分离到37株具有阿魏酸酯酶活性的丝状真菌,其中1株编号为HA4087的菌株具有较强的产阿魏酸酯酶能力。经形态学观察、18S rDNA和ITS序列鉴定为互隔交链格孢霉。对该菌株所产阿魏酸酯酶的粗酶性质进行了初步研究,结果表明,在发酵培养基中发酵粗酶活力为86 mU/mL,最适作用温度为55℃,最适pH值为5.5;在55℃保温30 min后酶活力仍为90%以上;在pH4.5-6.5范围内稳定性较好,酶活仍为85%以上。试验获得了产高酶活阿魏酸酯酶的菌株,为阿魏酸酯酶的工业化应用提供前提。