用圆二色性探测绿豆胰蛋白酶抑制剂的构象

绿豆胰蛋白酶抑制剂的紫外圆二色谱与一般球状蛋白质不同,属典型的Bowman-Birk抑制剂的图形,具有231nm正峰,245nm肩,275nm负峰及202nm大负峰。异硫氰酸苯酯修饰Lys活力中心后,使抑制剂失去一半活力,但CD谱变化不大。溴化氰处理后,抑制剂Arg活力区破坏,231nm峰消失,202nm峰变小。这两个峰可能与抑制剂特定的硫-硫键构象有关。研究了此抑制剂及上述衍生物与羊胰蛋白酶形成的络合物的CD谱。从CD谱看,羊胰蛋白酶属无规卷曲。络合物CD谱与两游离组分CD谱的加和谱比,有一些不同,但大体上是相似的。因此,络合物中两组分的构象与游离时的构象大体上相似。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N端的一个,而近C端的活性区域经CNBr裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅷ.两个活性碎片的拆分

1.绿豆胰蛋白酶抑制剂有二个活性中心,可以同时抑制两分子胰蛋白酶。用苯乙二醛及顺丁烯二酸酐分别进行化学修饰,都可使其活力降低至原有的50%左右,表明此两活性中心分别应为精氨酸残基及赖氨酸残基。2.绿豆抑制剂经胃蛋白酶酶解后,活力不丧失,在凝胶过滤中出现分子量为原抑制剂一半的新活力峰,经证实为两个不同活性中心的活力碎片。3.利用两活性中心残基赖氨酸和精氨酸侧链基团解离pK值的差异,在pH11.4的条件下通过固相胰蛋白酶亲和层析可将两活力碎片彼此分离。分离所得两碎片活力大致相等。4.以赖氨酸为活性中心的碎片能被顺丁烯二酸酐全部抑制失活,在pH3.5下保温却和原抑制剂一样能恢复其原有活力的90%以上。此活力碎片由两条肽链所组成,共含35个氨基酸残基,N-末端为丝氨酸和苯丙氨酸,两C-末端分别为亮氨酸及甲硫氨酸。5.以精氨酸为活性中心的碎片的活力能被苯乙二醛全部抑制,经鉴定为一条肽链,其含约27个氨基酸残基,N-末端为门冬酰胺,C-末端为门冬氨酸。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N 端的一个,而近C 端的活性区域经CNBr 裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N 末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C 末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH 下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH 低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH 下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅷ.两个活性碎片的拆分

1.绿豆胰蛋白酶抑制剂有二个活性中心,可以同时抑制两分子胰蛋白酶。用苯乙二醛及顺丁烯二酸酐分别进行化学修饰,都可使其活力降低至原有的50%左右,表明此两活性中心分别应为精氨酸残基及赖氨酸残基。2.绿豆抑制剂经胃蛋白酶酶解后,活力不丧失,在凝胶过滤中出现分子量为原抑制剂一半的新活力峰,经证实为两个不同活性中心的活力碎片。3.利用两活性中心残基赖氨酸和精氨酸侧链基团解离pK 值的差异,在pH11.4的条件下通过固相胰蛋白酶亲和层析可将两活力碎片彼此分离。分离所得两碎片活力大致相等。4.以赖氨酸为活性中心的碎片能被顺丁烯二酸酐全部抑制失活,在pH3.5下保温却和原抑制剂一样能恢复其原有活力的90%以上。此活力碎片由两条肽链所组成,共含35个氨基酸残基,N-末端为丝氨酸和苯丙氨酸,两C-末端分别为亮氨酸及甲硫氨酸。5.以精氨酸为活性中心的碎片的活力能被苯乙二醛全部抑制,经鉴定为一条肽链,其含约27个氨基酸残基,N-末端为门冬酰胺,C-末端为门冬氨酸。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅸ.两活力碎片及抑制剂的一级结构

前文已报道绿豆胰蛋白酶抑制剂经胃蛋白酶酶解后能使两个活性区域拆开,分离后的两活力碎片,经证实它们的活性中心分别为Lys及Arg,并测定了各自的氨基酸组成及N、C末端。今在此基础上确定了绿豆抑制剂的全部氨基酸排列顺序。一、绿豆抑制剂N端的氨基酸顺序天然绿豆胰蛋白酶抑制剂在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示有四条不同粗细的条纹,样品的N末端分析主要有Ser及Asp,它们是属于差异极少的异构体,具有完全相同的活     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅸ.两活力碎片及抑制剂的一级结构

前文已报道绿豆胰蛋白酶抑制剂经胃蛋白酶酶解后能使两个活性区域拆开,分离后的两活力碎片,经证实它们的活性中心分别为Lys 及Arg,并测定了各自的氨基酸组成及N、C 末端。今在此基础上确定了绿豆抑制剂的全部氨基酸排列顺序。     

山东产野生大豆胰蛋白酶抑制剂的初步研究

该实验建立了HPLC测定大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)活性的方法,并对山东产野生大豆(G.soja)与同地区产的黑豆和黄豆(G.max)的胰蛋白酶抑制活性差异进行了比较.用耦合了胰蛋白酶的亲合色谱柱对野生大豆的STI进行分离纯化,紫外分光光度法比较3种大豆的STI含量;PCR结合TA克隆技术对野生大豆STI中的Kunitz型(KSTI)蛋白基因编码区的氨基酸顺序进行初步测定.结果发现,山东产野生大豆的STI活性和含量均高于同地区产的黑豆和黄豆;山东产野生大豆的KSTI蛋白基因编码区的氨基酸顺序与已知的Tia型基本一致,仅第59位氨基酸由于单核苷酸的置换发生了Ser→Thr的转变,此位置位于活性中心附近.研究表明,山东产野生大豆胰蛋白酶抑制活性较强,且含量高.     

苦荞胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性研究

利用固相胰蛋白酶亲和色谱及离子交换色谱,从苦荞种子中分离纯化了三个具有抑制胰蛋白酶活力的组份(BTI-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)。经聚丙稀酰胺凝胶等电聚焦测定,三种抑制剂的等电点为6.87,6.7,5.14。根据Sephadex G-75凝胶过滤,SDS-PAGE测定,以及由当量抑制比值和氨基酸组份的推算,它们的分子量范围分别为5200-5700(Ⅰ),5500—6000(Ⅱ),5000—5600(III)。三者对胰蛋白酶的抑制常数分别为2.12×10~(-8),4.78×10~(-9),1.22×10~(-8)。氨基酸分析结果表明,它们均含有很高的极性氨基酸。在酸性条件下,它们均具有很高的热稳定性。化学修饰的结果表明,它们活性中心的氨基酸残基为Lys。     

荞麦胰蛋白酶抑制剂的原核表达及纯化

根据文献报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及本研究室先前已获得的部分基因序列设计引物,经过RT-PCR扩增,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂编码区基因全序列.将该基因克隆到原核表达载体pQE-31中,并转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达获得可溶性目的蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的25%.该目的蛋白经Ni2 -NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE分析显示,在大约9kD处出现明显的目的条带,与预计蛋白分子量大小一致.Western blot鉴定证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.活性测定表明,目的蛋白具有专一性的胰蛋白酶抑制剂活性,抑制活性约为77U/mg纯化蛋白.本实验为进一步研究荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系奠定了基础.     

甘薯和花生胰蛋白酶抑制剂的初步研究

许多植物蛋白制成品均含有抑制动物消化的蛋白酶抑制剂。目前已从某些豆类及蔬菜种子中分离出多种对胰蛋白酶具有抑制作用的活性物质。该实验以花生、甘薯等为原料,通过DEAE-Sepharose4BFF阴离子交换柱层析分离胰蛋白酶抑制剂,以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物测定其对胰蛋白酶的抑制活性;将具有抑制活性的组分通过SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量(Mr);以聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质等电点(pI)。结果显示,甘薯中至少有4种胰蛋白酶抑制剂组分,相对分子质量为20～25kD、等电点在pH5.0～6.6之间;花生中至少有三种胰蛋白酶抑制剂组分,相对分子质量为30～70kD、等电点在pH5.0～5.8之间。     

半夏胰蛋白酶抑制剂的纯化与部分性质研究

应用以胰蛋白酶为配体的亲和层析法,从生半夏蛋白粗提液的40％（NH。）：SO4（M／V）沉淀中分离纯化出一种胰蛋白酶抑制剂（Rhizoma pinelliae trypsin inhibitor,RVn）,经SDS．PAGE检测呈现单一条带,分子量为14kD左右,其N-端6个氨基酸残基顺序为DPVVDG。研究表明,其对胰蛋白酶的质量抑制比为l：4．72左右,对人低分化胃腺癌细胞系（BGC-823）的细胞增殖具有抑制作用,IC50值为121．53μg／mL。     

鹰嘴豆种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与鉴定

为了寻找具有药物作用的天然胰蛋白酶抑制物,采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析(DEAE-纤维素52)及Sephadex G-100凝胶层析等方法, 从鹰嘴豆种子中分离出一种鹰嘴豆胰蛋白酶抑制剂（CPTI）. 研究表明：CPTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制率达80%,而对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱,抑制率为32%, 对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制作用; 用SDS-PAGE测得CPTI近似分子质量为25.7 kD; CPTI具有较高的热稳定性,在100 ℃下加热60 min,对胰蛋白酶活性仍保持78%抑制率; Lineveaer-Burk作图得知该抑制剂属竞争性抑制类型. 动力学测定显示,来自鹰嘴豆中的CPTI对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为3.99×10^-7 mol/L.     

刺桐属胰蛋白酶抑制剂的结构与生物活性关系

刺桐胰蛋白酶抑制剂（ETI）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂,它能和胰蛋白酶及瑞替普酶（r-PA）等精氨酸特征性的丝氨酸蛋白酶发生了可逆亲合作用,根据此特性可将ETI作为固定配基制备成亲合填料,用于大规模高效分离r-PA,满足临床对溶栓制剂r-PA的大量需求,本对刺桐属胰蛋白酶抑制剂的结构与抑制活性关系进行综述。     

海芋胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究

利用亲和层析和分子筛凝胶过滤等技术,从海芋根茎中分离纯化到一种胰蛋白酶抑制剂,简称ＡＭＴＩ。经ＰＡＧＥ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定均显示单一条带,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定,其分子量为２２０００,经等电聚焦（ＩＥＦ）测定,其等电点为６．２。根据对胰蛋白酶的抑制比可知该抑制剂为单头抑制剂,其抑制活性在６０℃和ｐＨ５￣１１范围内保持稳定。     

萌发绿豆中水解大豆胰蛋白酶抑制子蛋白酶的纯化及固定化

大豆是豆类植物中最早发现存在蛋白酶抑制子的 ,由于其存在影响了豆类的利用价值 ,因此研究人员一直在寻找着解决办法。采用加热处理方法不能彻底钝化豆类蛋白的蛋白酶抑制子活性 ,且豆类蛋白的含硫氨基酸主要存在于各类蛋白酶抑制子中 ,从豆类蛋白中除去抑制子蛋白将大大降低其营养效价。本研究的目的是试图寻找一种可在常温下降解豆类胰蛋白酶抑制子的蛋白酶 ,从而钝化豆类的胰蛋白酶抑制活性。在前期工作中 ,我们发现枯草杆菌蛋白酶 (Ｓｕｂ ｔｉｌｉｓｉｎ)可在在常温下降解花生及大豆胰蛋白酶抑制剂[1] ,近期我们的研究表明 ,Ａｌｃａ…     

用单链和PCR相结合的方法合成绿豆胰蛋白酶抑制剂基因

本文报道用单链与PCR技术相结台的合成方法合成了胰蛋白酶抑制剂基因,包括氨基酸编码顺序、起始和终止密码子,上、下游两端的EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ限性酶识别顺序等全长共248个碱基对。合成基因的编码是参考其它植物的蛋白酶抑制剂基因的同源编码和植物基因的偏爱密码子来进行设计的。合成的基因双链经限制酶EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ在两端切出粘性末端后克隆到pUCl9中,克隆基因结构的正确性经过限制酶图谱和DNA序列分析得到完全的证明。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅱ.抑制剂A、B组份的关系及其化学结构的特征

前文曾报导自绿豆中抽提出两种结晶胰蛋白酶抑制剂A和B。但在制备过程中有时观察到A、B组份的比例有所改变,若A增多则B减少,反之亦然;若在热TCA中处理过份激烈,A有时又可一分为二。这是由于组織中确有两种或更多的组份存在,还是由于在制备过程中条件比较激烈,人为地由同一组份派生而来?为求确定此问题,我们在抽提过程中逐步观察了组份A和B间的关系,发现A确是由B派生而来。A和B的氨基酸组成和N末端完全相同,仅在酰胺含量上有所差别。我们还分析比较了抑制剂化学结构上的若干特点。