革兰氏阴性细菌β-桶状结构外膜蛋白体外折叠的研究进展

除了细胞质膜,革兰氏阴性细菌细胞还有一层组成细胞壁的外膜(Outer Membrane)。膜蛋白是外膜的主要组成成分之一,绝大多数外膜蛋白是由反向平行的β-折叠(β-Strands)通过相邻的氢键结合形成的β-桶状结构蛋白(β-Barrel Proteins)。这些蛋白既可作为通道蛋白、转运蛋白、酶、受体、毒力因子,也可作为结构蛋白发挥稳定外膜的重要作用,它们是否正确折叠并整合到外膜对革兰氏阴性细菌的生存至关重要。大多数外膜蛋白易于重组表达和体外重折叠(in vitro refolding),并且折叠状态可通过多种方法测定,因此β-桶状结构外膜蛋白被当着模式蛋白来研究各类生物和非生物因子对膜蛋白折叠的影响,是膜蛋白研究的一大热点。本文将从β-桶状结构外膜蛋白体外折叠的研究方法和影响折叠的因素角度对近年相关研究进展进行综合述评,最后总结了外膜蛋白体外折叠模式,并结合作者的相关研究结果和观点对该领域的研究前景进行了展望。     

大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）研究进展

二硫键形成蛋白A(DisulfidebondformationproteinA,DsbA)是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶。综述了DsbA三维结构、进化过程、协助蛋白质体内外复性方面的研究进展。DsbA比硫氧还原蛋白具有更强的氧化性,其强氧化性来自于Cys30残基异常低的pKa值和不稳定的氧化型结构,通过定点突变的研究表明了Cys30残基是DsbA活性中心最关键的氨基酸残基之一。DsbA不论在体内与目标蛋白融合表达还是在体外以折叠酶形式添加,都能有效地催化蛋白质的折叠复性,同时DsbA还具有部分分子伴侣的活性。     

蛋白质工程和蛋白质折叠

蛋白质一级结构决定着高级结构。蛋白质肽链在适宜条件下会自动卷曲形成其相应的高级结构,即自动发生蛋白质折叠,其自动发生的原因和过程仍不十分清楚,但是随着蛋白质工程的日益兴起,这些与折叠有关的问题也愈显重要,就此已有文章进行过讨论[1,2]。反之,如把新兴的蛋白质工程手段(尤其是基因定点诱变技术)应用来研究这些折叠问题,必将推动蛋白质折叠的研究。本文将就蛋白质折叠与蛋白质工程相互影响的一些例子进行讨论。     

多肽淀粉样沉积形成机制研究进展

淀粉样肽(amyloid peptide)是一类在一定条件下易于形成沉积的多肽或者蛋白质。这类多肽或者蛋白在一定的组织部位沉积引起的细胞毒性和细胞凋亡被认为是一些疾病的主要原因。尽管这类多肽在一级结构上没有明显的同源性,但它们形成的沉积具有共同的结构特征,即这些多肽形成了具有β片层结构的纤维状聚集体。淀粉样沉积的形成机制尚不清楚。研究认为,在沉积过程中,多肽分子首先形成寡聚体,然后转变为规则的β折叠结构,进而组装形成淀粉样纤维。很多因素有助于这一转变,如多肽序列、氨基酸残基间的相互作用,介质的疏水性、温度、pH以及金属离子的浓度等。对多肽淀粉样沉积形成机制的深入研究将为探索相关疾病病因和开发治疗药物提供极有价值的依据。     

大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）研究进展

二硫键形成蛋白A（Disulfide bond formation protein A,DsbA）是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶。综述了DsbA三维结构、进化过程、协助蛋白质体内外复性方面的研究进展。DsbA比硫氧还原蛋白具有更强的氧化性,其强氧化性来自于Cys³⁰残基异常低的pKa值和不稳定的氧化型结构,通过定点突变的研究表明了Cys³⁰残基是DsbA活性中心最关键的氨基酸残基之一。DsbA不论在体内与目标蛋白融合表达还是在体外以折叠酶形式添加,都能有效地催化蛋白质的折叠复性,同时DsbA还具有部分分子伴侣的活性。     

脯氨酰顺－反异构酶的纯化及对重组蛋白质折叠反应的催化性能

脯氨酰异构是蛋白质折叠反应的限速步骤之一,体内被脯氨酰顺－反异构酶(PPI)所催化．为了研究PPI在重组蛋白体外折叠复性中的作用,我们自猪肾脏中纯化了PPI,并对重组蛋白的酶促折叠过程进行了探讨．结果表明,PPI催化的重组蛋白的折叠反应主要是提高了它们的折叠速率,而不增加正确折叠率和比活性,PPI在很低的浓度下即有很高的催化活性．     

大黄鱼QM-like(PcQM)蛋白生物信息学分析

[目的]通过分析PcQM蛋白质的结构,预测其高级结构和功能,为进一步研究PcQM蛋白提供理论依据。[方法]利用Blast P和相关分析蛋白质理化性质与结构的软件,对PcQM蛋白进行结构与功能预测分析。[结果]PcQM蛋白不存在N端信号肽,存在多个酶切位点,无跨膜结构,定位在细胞质中。不存在二硫键,该蛋白含26.05%α-螺旋结构(H),20.93%β-折叠结构(E),53.02%无规则卷曲(L)。最后,通过Swiss-Model程序预测了PcQM蛋白的三级结构。[结论]较全面地分析和预测了PcQM蛋白的理化性质、二级结构和三级结构等。为深入分析PcQM在大黄鱼(Larimichthys crocea)体内免疫调节功能研究,提供了理论依据。     

分子伴侣的多重功能

分子伴侣(molecular chaperone)在原核生物和真核生物的细胞中广泛存在.分子伴侣可稳定未折叠或部分折叠的多肽,并防止不适当的多肽链内或链间相互作用;有些分子伴侣也可与天然构象的蛋白质相互作用以促使寡聚态蛋白质发生结构重排.基于分子伴侣能识别并调节细胞内多肽的折叠,因此它们还具有介导线粒体蛋白跨膜转运,调控信息传导通路和转录、复制,以及参与微管形成与修复等功能.     

硫矿硫化叶菌P2分子伴侣基因的克隆表达及其性质

[目的]研究重组表达的硫矿硫化叶菌P2分子伴侣β亚基体外同源聚合体的结构和生化功能.[方法]利用PCR技术从硫矿硫化叶菌P2的基因组DNA中克隆得到分子伴侣β亚基的基因,将该基因克隆到表达载体pET-21a( )上并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达.对纯化后的β亚基单体进行体外聚合,利用透射电镜观察β分子伴侣的结构,并对其促蛋白折叠性质进行了研究.[结果]硫矿硫化叶菌P2分子伴侣β亚基基因在大肠杆菌BL21中实现了高效表达,纯化后的分子伴侣β亚基单体在ATP和Mg2 存在的条件下可自组装形成分子伴侣聚合体.透射电镜观察表明:该β分子伴侣具有Ⅱ型分子伴侣典型的双层面包圈结构,每个环由8个亚基构成.该β分子伴侣具有ATPase活性,最适反应温度为80℃;它不仅能够促进变性的绿色荧光蛋白(GFP)重新折叠,而且还能有效的提高木聚糖酶的热稳定性.[结论]本文根据P2基因组序列分析预测的分子伴侣基因设计引物,克隆表达了硫矿硫化叶菌P2分子伴侣的β亚基,纯化后对其进行体外聚合,透射电镜观察表明该聚合体具有Ⅱ型分子伴侣的经典结构,功能分析表明该β分子伴侣能够在体外促进异源蛋白质的折叠、提高其它酶分子的热稳定性.这为进一步深入研究嗜热古菌耐热抗逆的分子机制,奠定了良好的基础.     

多酚化合物对蛋白质构象疾病的抑制作用研究进展

多酚化合物是广泛存在于中草药或植物性食物中的生物活性分子。大量研究表明多酚化合物对蛋白质构象疾病具有防治作用，如可通过疏水作用抑制蛋白质或多肽形成淀粉样纤维或解聚淀粉样纤维，或者通过其抗氧化性降低淀粉样纤维对细胞的氧化损伤。本文综述了近年来中草药或食物来源的天然多酚化合物体外抑制蛋白质或多肽错误折叠和淀粉样纤维形成，以及在动物疾病模型体内的抑制效果及作用机理的研究进展，以期为该类化合物预防和减轻蛋白质构象疾病的应用提供基础参考。