紫云英细胞转化条件的研究

研究了紫云英（ＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｉｎｉｃｕｓＬ．）细胞遗传转化的条件。根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）经含乙酰丁香酮的低ｐＨ／ＰＯ３－４ 诱导培养后,用来感染紫云英下胚轴原生质体,随后的细胞ＧＵＳ瞬间表达活性显著提高,间接证明了上述预培养诱导活化了细菌ｖｉｒ基因,促进了Ｔ－ＤＮＡ 向植物细胞转移。在ＰＥＧ介导的ＤＮＡ 转移中,较高的ｐＨ 和Ｃａ２＋ 浓度能够提高细胞ＧＵＳ活性。质粒ＤＮＡ 浓度及启动子类型对外源基因在植物细胞内表达也有一定影响。采用外植体－农杆菌共培养法,获得ＧＵＳ和ＮＰＴ Ⅱ基因稳定表达的紫云英转化植株     

Expression of the Kidney Bean Phenylalanine-Ammonia Lyase Gene in the Hairy Roots of Astragalus sinicus

Using Agrobacterium rhizogenes, Astragalus sinicus plants were transformed with the kidney bean pal5 gene coding for phenylalanine-ammonia lyase (PAL). The hairy root culture thus obtained manifested enhanced PAL activity and lignin content in the cell walls; in addition, the transformed cells differed from the wild-type ones in several electrophysiological indices. In particular, the diffusion component of the total membrane potential of plasmalemma increased in the pal-transformed roots. The authors presume that the volume density of the protein-related negative charge of the cytoplasm increases in the transformed root cells along with changes in the cytoplasmic pH and pCa²⁺, the extent of coupling of these two indices, and the hydraulic conductivity of plasmodesmata.     

影响花椰菜农杆菌介导转化因素的研究

以花椰菜赛雪的带柄子叶为外植体,以MS为基本培养基,GUS基因为报告基因,分析了遗传转化过程中的影响因子,如预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、延迟筛选时间等对外植体瞬间表达和稳定表达的影响。结果显示,以花椰菜的带柄子叶为外植体,预培养2d,农杆菌菌液为OD6000.3～0.4,侵染8min,共培养2d,乙酰丁香酮浓度为100μmol/L,延迟筛选7d,卡那霉素筛选压为5mg/L为最优的遗传转化方案,转化率最高可达35.7%。另外,GUS瞬间表达率和转化率并不存在绝对的相关性,但瞬间表达分析仍然可以作为外源基因进入受体细胞的指示。花椰菜农杆菌介导转化方案的优化研究为芸薹属蔬菜高效遗传转化提供了技术保障,有利于芸薹属蔬菜遗传育种与种质创新研究。     

紫云英配施化肥对水稻氮素吸收利用和紫云英氮在水稻-土壤体系分配、残留的影响

明确紫云英配施化肥条件下水稻对氮素吸收利用和紫云英氮在水稻-土壤体系的吸收利用、分配及残留规律,能够为豫南稻区合理施肥提供依据.本研究利用原状土柱模拟和15N示踪技术,研究等氮条件下不施肥(CK)、化肥+22500 kg·hm-2紫云英(FM1)、化肥+30000 kg·hm-2紫云英(FM2)、化肥+37500 kg...     

取样策略对SSR标记鉴别紫云英品种能力的影响

紫云英属于异花授粉植物, 品种内个体基因型杂合, 品种鉴定难度大。本文以紫云英闽紫系列3个审定品种为材料, 采用SSR标记进行取样策略对3个品种鉴别能力影响的研究。结果表明：（1）固定4对引物组合,从5～50进行梯度取样时,品种内的扩增位点总数、观测等位基因数趋于增多,但有效等位基因数、Shanon信息指数、遗传多样性指数增大到最大值后趋于下降,其中总体样品的最大值是出现在取样量为30的时候;随着样品量的增加,品种间Nei氏遗传距离以及分子方差分析的品种间期望变异系数比例值（PhiPT）均呈减少趋势,但PhiPT值的置信度在增大;（2）固定品种的样品容量为30和50,再加入2对能扩增出在品种间形成频率差异的标记位点的SSR引物对,基于这6对SSR引物可以将参试的3个紫云英品种有效的区分,品种间期望变异系数比例值（PhiPT）提高且差异的置信度具有明显的统计学意义（P<0.001）。主成分分析进一步表明：3个参试品种30个样品与50个样品的散布状况基本一致。对紫云英取样策略的研究表明：为提高对参试品种的鉴别能力,样品取样量以30株为宜,即达到较佳鉴别效果又降低分析成本。     

紫云英AD-cDNA文库构建及与豆血红蛋白Lb相互作用靶蛋白的筛选

【目的】本文旨在构建紫云英酵母双杂交AD-cDNA文库和互作靶蛋白筛选平台,为深入研究共生固氮作用的分子机理奠定工作基础。【方法】以接种华癸中慢生根瘤菌7653R的豆科植物紫云英不同时期根部组织为材料,抽提和纯化RNA,构建了一个酵母AD-cDNA文库。库容量达到1.02×106/3μg pGADT7-RecDNA,插入片段大小1-1.5 kb左右。以紫云英豆血红蛋白基因AsB2510构建诱饵载体pGBKT7-AsB2510,利用酵母双杂交技术,筛选与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。【结果】在含有X-gal的SD四缺培养基上筛选得到26个克隆,经过质粒抽提、PCR鉴定、回转酵母验证获得10个阳性克隆。【结论】对阳性克隆的外源片段进行了测序和同源性分析,发现一个值得深入研究的含有tify domain和Divergent CCT motif的转录调控因子。     

雪花莲凝集素基因转化菊花及转基因植株的抗蚜性研究

针对菊花存在的蚜虫虫害问题,采用农杆菌介导法将gna基因导入菊花叶片,共获得93个转化克隆。研究了影响转化频率的主要因素,得出在使用pH5．6的YEB培养基,菌液浓度OD600=0．4,45日苗龄中部叶片预培养1d,共培养4d,共培养的培养基中加入0．5mg／L GA3的条件下可使转化频率提高到11．21％。PCR、实时荧光PCR检测结果表明,外源基因已整合到植物细胞基因组中。转化植株幼苗饲虫实验表明,不同转化克隆的抗蚜性差异较大,蚜口密度抑制率从10％—84％不等,平均蚜口密度抑制率为39．4％。转化植株叶片蛋白提取液对小鼠红细胞具有凝集作用。     

农杆菌介导法向玉米茎尖导入抗草甘膦EPSPS基因的研究

以玉米自交系郑58的茎尖为受体,通过农杆菌介导法将抗草甘膦EPSPS基因转入玉米中,研究以茎尖为受体的农杆菌转化体系的可行性。98株转化苗,经过300 ppm的除草剂(农达)筛选,共获得13株转基因植株,经PCR检测,其中7株表现阳性,转化率达7.14%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的。     

植物瞬时表达技术的主要方法与应用进展

瞬时表达技术是一种获得目的基短暂的高水平表达的技术.与稳定表达相比,瞬时表达所需时间短,但未将外基整合到宿主植物染色体中,不能稳定遗传给下一代.我们简要综述了植物瞬时表达技术的各种方法,介绍了各方法的理、技术流程、影响素及其应用.关其应用,主要分析了生物制剂的合成、转录元件和转录子的克隆与分析、基沉默、亚细胞定位、蛋白互作分析、抑制子功能鉴定、选择性剪接调控、植物品种的改良和选育等方面.     

Study on Optimization of Transformation of Populus tomentosa

Several factors affecting transformation of Populus tomentosa Carr. were studied, and a simple and effective protocol with optimized condition for transformation of P. tomentosa was developed. The results demonstrated that the transformation frequency was extremely increased with the presence of acetosyringone, and likely with the Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend) Conn density, duration of infection and co-cultivation. It was found that removal of CoCl2·6H20 from the co-culture medium was benefitial to obtain Kanr shoots.     

Isolation of the PCB-degrading bacteria Mesorhizobium sp. ZY1 and its combined remediation with Astragalus sinicus L. for contaminated soil

A bacterial strain ZY1 capable of utilizing PCBs as its carbon source was isolated from the root nodules of Chinese milk vetch (Astragalus sinicus L.). The strain was identified as Mesorhizobium sp. according to its physiological-biochemical properties and the analysis of its 16S rRNA gene sequence. When the initial OD600 was 0.15, 62.7% of 15 mg L^?1 3,3′,4,4′-TCB in a liquid culture was degraded by Mesorhizobium sp. ZY1 within 10 days. Mesorhizobium sp. ZY1 also greatly increased the biotransformation of soil PCBs. Pot experiments indicated that the soil PCB concentrations of a single incubation of strain ZY1 (R) and a single planting of A. sinicus (P) decreased by 20.5% and 23.0%, respectively, and the concentration of PCBs in soil treated with A. sinicus and strain ZY1 decreased by 53.1%. We also observed that A. sinicus-Mesorhizobium sp. ZY1 treatment (PR) improved plant biomass and the concentration of PCBs in plants compared with a single A. sinicus planting treatment (P). The results suggest that the synergistic association between A. sinicus and PCBs-degrading Mesorhizobium sp. ZY1 can stimulate the phytoextraction of PCBs and the rhizosphere microflora to degrade PCBs, and might be a promising bioremediation strategy for PCB-contaminated soil.     

两种质粒中gus基因在植物细胞和根癌农杆菌中的表达特性研究

以含有基因转化操作过程中常用的两种质粒载体pBI121和pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105为材料,分别转化甜瓜子叶,应用组织化学方法检测了甜瓜子叶和子叶培养后的愈伤组织及根癌农杆菌菌液的瞬时转化效果,研究了两种不同的质粒载体上所含的gus基因在根癌农杆菌中和植物细胞中的表达特性.结果表明,不同质粒载体上所含的gus基因的表达特性不同,质粒载体pBI121上所含的gus基因既能在植物细胞中能表达,也能在根癌农杆菌细胞中表达,而质粒载体pCAMBIA2301上所含的gus基因能在植物细胞中表达,但是不能在根癌农杆菌细胞中表达.     

根癌农杆菌转化条件优化的研究

目的:确立一个快速高效转化根癌农杆菌的实验方案。方法:以pCAMBIA1305.1质粒作为外源DNA转化农杆菌GV3101。通过对GV3101生长状态的测定,并对重悬液的种类和浓度、速冻时间、热处理温度等条件逐一进行筛选,以确定最适合GV3101转化的实验条件。结果:以TSS缓冲液重悬细胞,液氮速冻3min后于28℃热处理5min,农杆菌转化效率可达到105。结论:改进的转化方法转化率高,重复性好,简单易行,为用农杆菌介导法进行植物遗传转化的第一个限速步骤提供了很好的解决方案。     

口蹄疫抗原决定簇融合基因转化生菜及表达

以3-5天苗龄的散叶大速生生菜(Lactuca sativa var.capatata)无菌苗子叶为外植体,通过根癌农杆菌介导,将携带O型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21-O14-A21-HBcAg导入生菜.研究结果表明,含有20 mg·L-1潮霉素(Hyg)的S2培养基(MS 1.5 mg·L-1 6-BA 0.2 mg·L-1IAA 20 mg·L-1Hyg 300 mg·L-1Cb)为子叶外植体转化后诱导愈伤和芽再生的最适培养基,经抗性筛选,将抗性芽切下于S3培养基(1/2MS 20 mg·L-1Hyg)上诱导生根.通过PCR和Southern杂交分析证明,基因已经整合到生菜基因组中.RT-PCR检测初步表明,O21-O14-A21-HBcAg基因可以在生菜中正常转录.     

胡杨转基因体系的建立

胡杨（Populus euphratica）是唯一能在沙漠里生长的高大乔木树种,建立其转基因体系可为胡杨抗逆分子机制与应用技术研究提供基本方法。通过研究农杆菌介导的胡杨转GUS基因的技术体系得出以下结论：（1）胡杨再生植株体系,叶片在附加1.0μmol·L^-1 6-BA和5.0μmol·L^-1NAA的1/2MS培养基上不定芽诱导率较高;（2）转基因体系,胡杨叶片在含100μmol·L^-1乙酰丁香酮的OD600值为0.4-0.6的根癌农杆菌菌液中浸染15分钟,共培养2天,GUS基因转化效率较高;（3）转基因植株抗生素筛选,转GUS基因胡杨叶片用300mg·L^-1头孢霉素抑制农杆菌生长,在含9mg·L^-1G418的培养基上诱导不定芽以获得转基因的抗性植株。     

Improved shoot regeneration protocol for hairy roots of the legume Astragalus sinicus

An improved protocol for shoot regeneration from hairy roots transformed by Agrobacterium rhizogenes of the legume species Astragalus sinicus (Chinese milk vetch) has been developed. The A. rhizogenes strain DC-AR2 harboring the binary vector pBI121 which carries the uidAgene encoding -glucuronidase activity and the kanamycin resistance gene nptII, was used to transform cut ends of plantlet hypocotyls. Transformed hairy roots were selected on medium containing 75 g ml^–1 kanamycin, and transformation was monitored by detection of the opine mikimopine, histochemical -glucuronidase activity, the polymerase chain reaction, and Southern blot analysis. The cytokinins benzylaminopurine, kinetin, and thidiazuron suppressed the growth of 8-month and 3-year-old hairy roots, but were necessary for adventitious shoot formation that could occur with some lines. Putative somatic embryos developed from transformed roots on medium with 7.5-10.0 mg l^–1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Light did not affect shoot regeneration from transformed hairy roots. This transformation and shoot regeneration system should be useful for testing gene expression quickly and be amenable to studies of shoot morphogenesis and interactions with rol gene expression.     

根癌农杆菌介导的香蕉遗传转化研究进展

香蕉的栽培品种绝大多数是三倍体, 常规育种难度大, 工作周期长, 难以采用传统的育种方法进行遗传改良, 因此转基因技术成为改良香蕉种质的有效方法。根癌农杆菌介导的香蕉的遗传转化从20世纪90年代起取得的了较大的进步, 但仍然存在着很多问题。文章分析了影响农杆菌介导香蕉转化的几个重要环节, 并对其研究现状、存在的问题及应用前景作简要概述。     

农杆菌介导的植物基因转化研究进展

农杆菌介导的植物基因转佛当今植物基因转化的主要方法之一,因而深受关注,本文从农力介导的基因转化机理,植物对农杆菌侵染的反应,转基因植物的遗传表达,以及农杆菌对单子叶植物的转化等方面论述了该领域的最新研究进展,并提出了进一步研究的方向。     

根癌农杆菌转化紫草的研究

紫草 (ＬｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎＳｉｅｂ .ｅｔＺｕｃｃ)是传统中药。其根部含有萘醌类化合物—紫草素及其衍生物 ,具有显著的抗菌、抗炎、抗癌以及促进伤口愈合等生理活性。紫草素同时也是一种名贵化妆品染料。科学家对紫草的研究兴趣是基于其资源的缺乏及紫草植物本身所具有的一些特点 ;如 :紫草素及其衍生物的颜色特性可凭借肉眼观察 ,紫草素及其衍生物只在紫草的根部积累 ,紫草素合成的次生代谢途径受多种酶和外界条件 (光照 ,营养等 )的调节等。紫草细胞培养 (Ｆｕｊｉｔａ等 ,1983;叶和春等 ,1991)可以产…