α-环糊精糖基转移酶活性区域突变提高选择形成γ-环糊精能力

探讨α-环糊精糖基转移酶(CGT酶)活性区域-3亚位点(47位赖氨酸残基),-7亚位点(146~152位氨基酸残基)以及环化中心位点(195位酪氨酸残基)对其催化底物形成γ-环糊精(CD)能力的影响。将α-CGT酶相应位点分别进行如下突变:K47T,Y195I,以及146~152位氨基酸残基替换为异亮氨酸(命名为△6),并在大肠杆菌BL21中实现异源活性表达。以可溶性淀粉作为底物进行转化,利用HPLC分析各种突变酶的催化产物中3种环糊精产量和比例。结果表明,和野生酶相比,所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面,突变酶Y195I的催化产物中,α-CD的含量由68%降为30%,β-CD由22.2%提高为33.3%;而γ-CD由8.9%提高为36.7%,含量提高了4倍,取代α-CD成为产物中的主要成分;γ-CD的实际产量为1.1 g/L,是野生酶(0.4 g/L)的3倍。突变酶K47T和△6的转化产物中α-CD比例有不同程度下降,但仍然是产物中的主要组分,β-和γ-CD的比例都有所增加。由此可见,活性区域中195位氨基酸对于α-CGT酶的活力和催化选择性具有重要的影响,Y195I突变体酶最有利于选择性形成γ-CD。纯化后突变酶Y195I的酶学性质试验表明,其最适反应温度和野生酶相同,但最适反应pH有所提高,且比野生酶具有更好的pH稳定性。因此,突变酶Y195I具有生产制备γ-CD的潜力。     

酶法合成2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)条件的研究

采用单因素优化法对环糊精葡萄糖苷转移酶(CGTase)合成糖基抗坏血酸(AA-2G)条件进行优化,AA-2G的产量为2.76 g/L,比未优化前0.46g/L提高了500%。再采用响应面法对AA-2G合成条件进行优化。由Plackett-Burman法筛选出三个主要因素为:pH、V_C和麦芽糊精浓度;由最陡爬坡实验得出最佳响应面区域;最后由Box-Behnken实验,得到最优条件为:pH 5.51,V_C36.16g/L,麦芽糊精28.54 g/L,转化时间24 h,温度37℃。在此条件下,AA-2G的理论产量为3.15 g/L,通过验证实验,得出AA-2G的产量为3.13 g/L,与预测的理论值接近,比单因素优化的结果(2.76g/L)提高了14%。     

鉴别杰多霉素生物合成后修饰氧化酶JadH中参与底物结合或催化的关键残基

JadH是羟化脱水双功能酶,参与杰多霉素生物合成中的聚酮后修饰反应,将2,3-dehydro-UWM6催化为dehydrorabelomycin。为了分析杰多霉素生物合成途径中后修饰氧化酶JadH结合、催化底物的关键氨基酸,构建了JadH与底物复合物的三维结构模型。利用该模型并结合JadH同源蛋白氨基酸序列比对分析,推测出JadH活性中心中可能参与底物结合或催化的关键氨基酸(R50、G51、L52、G53、F100、R221、I223、P295和G298)。通过定点突变及体外酶学实验对这些位点的突变体的催化活性进行评价,结果显示这些突变株活性均显著低于野生型,表明这9个氨基酸是JadH参与底物结合或催化的关键氨基酸。     

唾液乳杆菌BSH1及其突变体的底物特异性

为了解析胆盐水解酶催化中心中关键氨基酸位点与其底物特异性的关系,以大肠杆菌pET-20b(+)表达系统为分子改造平台,采用理性设计,结合氨基酸定点突变的方法,成功构建了唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius胆盐水解酶BSH1的7种突变体。通过对比L.salivarius BSH1及其突变体对6种结合胆盐的底物特异性表明,7种突变体对不同的结合胆盐的水解活性有所改变。结果说明,Cys2和Thr264分别是BSH1催化TCA和GCA的关键残基,且对酶的催化活性的保持具有关键作用。其中,高保守性的氨基酸位点Cys2不是BSH1唯一的活性位点,而其他突变的氨基酸位点可能作为BSH1的结合位点参与了底物的结合,也可能影响了底物进入BSH1活性中心的通道或底物结合口袋的体积与形状,进而影响了BSH1对不同结合胆盐的水解活性。     

基于磷脂酶水解圈定向筛选高效聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶

【目的】目前自然环境中聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)废弃物的积累严重威胁生态健康,因此PET的降解问题已成为全球性的热点问题。生物酶法降解PET技术以其绿色环保而备受关注,但天然PET降解酶的催化活性普遍偏低,亟待进一步定向改造。现阶段定向进化为快速提高PET降解酶催化性能提供了可能,其中筛选方法是成功获得高性能突变体的关键所在。本研究旨在提出一种新型高效灵敏的筛选方法并应用于褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)来源角质酶Tfu-0883的定向改造,以期快速获得PET降解活性提高的突变体。【方法】基于易错PCR构建突变体文库,涂布于卵黄磷脂平板,以水解圈的大小作为筛选指标获得PET降解活性提高的突变体;对突变体进行酶学定性并筛选出潜在的分子改造位点,最终获得高性能突变体。【结果】从卵黄磷脂平板中挑取水解圈直径最大的单菌落,即突变体H10(N2D/D94H/A149E),其PET降解能力是野生型的1.5倍,最适温度与pH分别为60℃和8.0。突变体H10中第2位和第149位氨基酸残基远离底物结合凹槽,其突变会导致酶蛋白稳定性下降;第94位氨基酸残基则位于底物结合凹槽附近,由负电荷氨基酸Asp突变为正电荷氨基酸His,有利于吸附在带负电荷的PET表面,是突变体H10降解能力提升的关键因素;随后将野生型的第94位氨基酸残基Asp分别突变为His及同为正电荷且空间位阻更小的Lys和Arg,突变体D94H、D94K和D94R对PET降解能力均有提升,其中,突变体D94K降解PET能力是野生型的3.6倍。【结论】本研究基于磷脂酶水解圈构建了一种新的PET降解酶定向筛选方法,以此获得了降解活性提高的突变体,并证实角质酶Tfu-0883第94位氨基酸残基位点具有提升其PET降解活性的潜在能力。     

亚热带山区土壤未培养微生物L-赖氨酸脱羧酶Ldc1E中关键氨基酸残基的功能鉴定

本研究旨在探讨L-赖氨酸脱羧酶Ldc1E关键氨基酸在底物识别和催化过程中的作用;通过生物信息学方法选择突变位点,并利用直接定点突变技术,完成了6个关键氨基酸残基突变和功能鉴定研究。突变酶D692N最适温度和pH值分别为40℃和6.5。突变酶D692N比野生型Ldc1E对高温具有更强的耐受性,在40℃～55℃温浴1 h后剩余酶活力达到35%以上,在60℃温浴1 h后仍然保留20%的酶活力;而野生型酶Ldc1E在50℃以上温浴1 h后几乎失活。此外,50 mmol/L DMSO、5 mmol/L Al~(3+)和Ca~(2+)对突变酶的酶活力有激活作用,而Al3+对野生型酶Ldc1E具有明显抑制作用。突变酶D692N的分子动力学常数K_m升高了1.78倍,k_(cat)下降了20.2倍。突变酶S221A、H245A、D330A、H366A、F607Y经检测酶催化活性丧失。研究结果表明氨基酸残基位点D692对酶与底物的结合具有重要影响;而S221、H245、D330、H366、F607是Ldc1E酶活性能够体现的关键氨基酸位点,不可替换。本研究为探究L-赖氨酸脱羧酶的结构与功能关系提供理论参考。     

人类线粒体肌酸激酶uMtCK的底物结合位点分析

研究人类线粒体肌酸激酶u Mt CK的结合位点,将其与底物肌酸和ATP结合有关的关键氨基酸进行突变,并对突变体进行酶动力学和圆二色谱数据分析,探讨这些关键氨基酸在底物识别和催化过程中的作用。结果显示,与野生酶相比,突变体Q313A和R336A的K_m~(Cr)分别提高了2.6和2.9倍,k_(cat)下降了19%和55%;同样地,与ATP结合相关的突变体R125A和R287A分别使得K_m~(ATP)升高了3.2和4.2,k_(cat)下降了72%和38%。以上结果表明突变体R125A、R287A、Q313A和R336A影响对底物的结合,同时也降低了酶促反应的速度。利用圆二色谱比较野生酶与不同突变体的二级结构并无明显变化,但进一步的结构模拟表明底物结合位点氨基酸在与底物之间的氢键对底物的识别和酶催化过程中发挥着重要作用。     

嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶活性位点的确立

【目的】通过定点突变确定嗜酸热脂环酸杆菌中甘露聚糖酶的活性催化位点。【方法】根据序列比对和GH53家族的结构信息选择可能的催化活性位点,利用重叠PCR法构建定点突变体,采用薄层层析(TLC)法和3,5-二硝基水杨酸(DNS)法检测各酶蛋白活性。【结果】通过重叠PCR法成功构建了7个位点的突变体,其中第150和159位的氨基酸突变对活性改变甚少或几乎没有,而第151和231位谷氨酸的羧基基团的改变以及双位点突变体E2Q则导致其对各种底物催化活性的丧失,说明位于β4和β7折叠的C末端的E151和E231的羧基基团作为功能基团参与了催化反应。【结论】E151和E231分别是新型甘露聚糖酶AaManA的酸碱催化位点和亲核催化位点。     

酸性木聚糖酶XynⅡ活性中心关键氨基酸残基的鉴定

目的:鉴定来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的酸性木聚糖酶XynⅡ活性中心关键氨基酸残基。方法:对XynⅡ进行SWISS-MODEL同源建模和BLAST序列比较,分析XynⅡ中所有可能作为催化残基的保守氨基酸,采用定点突变手段对其进行鉴定研究。结果:只有Glu-79和Glu-170位于酶与底物作用的活性中心,它们分别位于β折叠股B6和B4上,推测Glu-79和Glu-170为XynⅡ活性中心关键氨基酸残基。将Glu-79和Glu-170突变为酸性的Gln,突变酶E79Q,E170Q在大肠杆菌和毕赤酵母中表达后,活性均丧失。结论:79位、170位Glu是木聚糖酶XynⅡ活性中心的关键氨基酸残基,为该酶进一步的结构与功能研究提供了理论基础。     

用定位突变方法对人脑己糖激酶活性位点的研究

哺乳动物己糖激酶Ⅰ的分子量是１００ｋＤ．目前已经认为是由分子量５０ｋＤ酵母型己糖激酶通过基因复制和融合进化来的．己糖激酶Ⅰ的Ｃ端半分子包含了底物葡萄糖的结合位点即催化位点．Ｘ射线衍射结构的结果已经推测在酵母型的己糖激酶分子中Ｓｅｒ－１５８、Ａｓｐ－２１１是和葡萄糖的结合及催化活性有关,这些氨基酸残基相当于人脑己糖激酶Ⅰ分子中的Ｓｅｒ－６０３、Ａｓｐ－６５７,它们正好位于该酶分子的Ｃ端半分子中．定位突变这两个氨基酸残基得到４个该酶的Ｃ端半分子酶（ｍｉｎｉ－ＨＫⅠ）的突变体,它们是Ｓｅｒ－６０３→Ｃｙｓ,Ｓｅｒ－６０３→Ｔｈｒ,Ａｓｐ－６７５→Ｇｌｕ,Ａｓｐ－６７５→Ｖａｌ．实验结果指出４个突变体酶的Ｋｍ值变化不大,但酶活性只保留野生型酶的０．２８％～１１％,园二色谱分析４个突变体的ＣＤ谱与野生型酶基本一致,因此说明二级结构没有变化．这些研究结果和Ｘ射线衍射结构的推断是一致的,显示了Ｓｅｒ－６０３和Ａｓｐ－６５７氨基酸残基在该酶结合底物葡萄糖或催化作用上起了重要的作用．     

Separation and simultaneous determination of nalidixic acid, hydroxynalidixic acid and carboxynalidixic acid in serum and urine by micellar electrokinetic capillary chromatography

Separation in capillary electrophoresis is governed by various factors, including buffer type, buffer concentration, pH, temperature, voltage and micelles. Through proper adjustment of these parameters, nalidixic acid and its two major metabolites, 7-hydroxynalidixic and 7-carboxynalidixic, could be separated by micellar electrokinetic capillary chromatography using an electrophoretic electrolyte consisting of 50 mM borate buffer (pH 9) containing 25 mM sodium dodecyl sulphate and 10% acetonitrile. A linear relationship between concentration and peak area for each compound was obtained in the concentration range 0.15–100 μg ml⁻¹, with a correlation coefficient greater than 0.999 and detection limits in the 0.2–0.7 ng ml⁻¹ range. Intra- and inter-day precision values of about 0.8–1.2% RSD (n=11) and 1.3–2.0% RSD (n=30), respectively, were obtained. The method has been applied to the analysis of nalidixic acid and its two major metabolites in serum and urine with limits of sensitivity lower than 0.8 ng ml⁻¹.     

酚酸类物质对三七幼苗的化感影响

该文研究了不同浓度的阿魏酸、对香豆酸、丁香酸、对羟基苯甲酸、香草酸5种酚酸类物质对三七幼苗生长和生理的影响。结果表明:处理后,三七幼苗的苗高、根长、可溶性蛋白质含量、根系活力、CAT以及POD活性均有所降低。其中,阿魏酸各处理组幼苗的苗高及POD活性均显著降低,50、100 mg·L~(-1)的对香豆酸以及100 mg·L~(-1)的香草酸处理组幼苗苗高也分别比对照显著降低16.19%、16.67%和29.29%;对香豆酸、丁香酸以及对羟基苯甲酸各处理组幼苗根长均显著低于对照;香草酸处理组幼苗的根系活力也显著低于对照,且幼苗的CAT活性在10、50、100 mg·L~(-1)丁香酸、对羟基苯甲酸以及香草酸处理下也达到了显著降低水平。此外,1 mg·L~(-1)阿魏酸以及100 mg·L~(-1)香草酸处理组幼苗的叶绿素含量也均显著降低;中高浓度的阿魏酸、对香豆酸、丁香酸、对羟基苯甲酸增加了三七幼苗的MDA含量,而香草酸在0.1、1、10、100 mg·L~(-1)浓度下显著降低幼苗的MDA含量;丁香酸、香草酸、对羟基苯甲酸以及中高浓度的对香豆酸增加了三七幼苗的SOD活性,且香草酸各处理组均达到了显著性水平。综上结果表明,5种酚酸类物质对三七幼苗均具有一定的化感抑制作用,但各酚酸物质的作用方式及强度并不完全一致,阿魏酸的化感影响较大,这为进一步研究三七的化感自毒作用提供了一定的理论参考。     

Comparative acid stress response of Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 and Salmonella Typhimurium after habituation at different pH conditions

AIMS: The aim of the study was to evaluate the effect of habituation at different pH conditions on the acid resistance of Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serotype Typhimurium, and to identify potential differences between the adaptive responses of the three pathogens. METHODS: Stationary phase cells of L. monocytogenes, E. coli O157:H7 and S. Typhimurium, grown in glucose-free media, were exposed to pH 3.5 broth directly or after habituation for 90 min at various pH conditions from 4.0 to 6.0. Survivors at pH 3.5 were determined by plating on tryptic soy agar and incubating at 30 degrees C for 48 h. The kinetics (death rate) of the pathogens at pH 3.5 was calculated by fitting the data to an exponential model. RESULTS: Habituation to acidic environments provided protection of the pathogens against lethal acid conditions. This acid protection, however, was found to be pH dependent. For example, for E. coli O157:H7 an increased acid resistance was observed after habituation at a pH range from 4.0 to 5.5, while the maximum acid tolerance was induced at pH 5.0. Furthermore, the effect of low pH habituation was different among pathogens. For L. monocytogenes, E. coli O157:H7 and S. Typhimurium, the pH range within which habituation resulted to increased acid resistance was 5.0-6.0, 4.0-5.5 and 4.0-5.0, respectively, while the maximum acid tolerance was induced after habituation at pH 5.5, 5.0 and 4.5, respectively. SIGNIFICANCE: Acid stress conditions are common within current food processing technologies. The information on adaptive responses of L. monocytogenes, E. coli O157:H7 and S. Typhimurium after habituation to different pH environments provided in the present study, could lead to a more realistic evaluation of food safety concerns and to a better selection of processes in order to avoid adaptation phenomena and to minimize the potential for food safety risks.     

Temperature regulates tuber-inducing lipoxygenase-derived metabolites in potato (Solanum tuberosum)

Temperature is one of the major environmental factors affecting potato tuberization. It has been suggested that lipoxygenase (LOX) mediates between temperature and tuber induction. In this study, the contents of the LOX-derived metabolites hydroperoxylinolenic acid (HPOT), jasmonic acid (JA), tuberonic acid (TA) and tuberonic acid glucoside (TAG) were analyzed in leaves of potatoes growing at different temperatures. At low, tuber-inducing temperature, endogenous levels of JA, TA and TAG rise, indicating their crucial role in tuber induction. The concentration of 13(S)-HPOT seems not to be directly affected by temperature. Instead, the molecule has only a short half-life in leaves and is readily metabolized.     

Triterpene acids from Salvia and Teucrium species

The pentacyclic triterpene acids ursolic acid, oleanolic acid, micromeric acid, maslinic acid and 3-epi-maslinic acid have been isolated from several Salvia and Teucrium species.     

氨基酸分析仪测定饲料添加剂——叶酸的方法

用６ｍｏｌ／Ｌ盐酸于１１０℃条件下水解饲料添加剂——叶酸,使之游离出谷氨酸,用氢氧化钠中和调节ｐＨ到２,氨基酸分析仪测定谷氨酸含量,经与标准叶酸水解样品比较,计算出叶酸的纯度。该方法重现性好,变异系数ＣＶ＝０．０８％,平均回收率为９８．３４％,浓度与峰面积呈线性相关,相关系数ｒ＝０．９９８７,可随氨基酸分析同时进行,不需改变任何分析条件。     

硬枝树花中抑制H_22荷瘤小鼠肿瘤的活性成分研究

研究了从硬枝树花中提取得到的4个单体化合物松萝酸(usnic acid)、去甲环萝酸(evernic acid)、巴尔巴地衣酸(barbatic acid)和水杨嗪酸(salazinic acid)对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用,并且对抑瘤率、胸腺指数、脾指数及小鼠白介素-2含量等各个指标的进行检测,以说明此4种化合物对小鼠肿瘤生长的抑制效果。结果表明,松萝酸高、中剂量组,去甲环萝酸高、中剂量组,巴尔巴地衣酸低剂量组,水杨嗪酸高剂量组对小鼠肿瘤有较好的抑制效果,与阴性对照组比较有极显著差异(P0.01),并且这些组的H22荷瘤小鼠血清中白介素-2的含量显著增加,与抑制肿瘤活性具有相关性。