人白细胞介素11 cDNA的克隆、融合表达及活性测定

取人胎肺做原代培养细胞,ＰＭＡ诱导后,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,扩增出去了Ｎ端信号肽序列的ＩＬ１１ｃＤＮＡ,经序列分析表明,该序列与文献报道序列高度同源,仅３个核苷酸有变化,氨基酸序列一致。将此ＩＬ－１１ｃＤＮＡ克隆人硫氧还蛋白基因融合表达载体ｐＴＲＸＦＵＳ的ｔｒｘＡ基因３‘末端,利用其３’端的蛋白肠激酶切点。构建符合读码框的融合基因。该融合蛋白在大肠杆菌中表达量法２０％以上。用ＩＬ－６依赖细胞株７Ｔ     

重组FAS分子的表达、纯化及抗体制备

用ＰＣＲ法扩增出编码人ＦＡＳ分子胞外区的ｃＤＮＡ片段,直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,经ＤＮＡ序列测定后,再插入到谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－ＫＧ的ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ位点之间,构成重组质粒ｐＫＧ－ｈＦＡＳ,将此质粒导入大肠杆菌,经ＩＰＴＧ诱导后获得ＧＳＴ－ｈＦＡＳ重组融合蛋白的表达,用谷胱甘肽偶联的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ经亲合层析获得纯化的ＧＳＴ－ｈＦＡＳ蛋白,经凝血酶酶切和二次亲合层析去除ＧＳＴ部分,得到纯化的ＦＡＳ蛋白．用纯化的ＦＡＳ抗原免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体,经检测发现抗ＦＡＳ抗体能诱导Ｕ９３７细胞发生细胞凋亡     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

人白细胞介素－3在大肠杆菌中的高效表达

人白细胞介素－３（ｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３,ｈＩＬ－３）是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用ＰＣＲ方法从人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出０．４４ｋｂ的ＤＮＡ片段,并克隆入ｐＵＣ１９载体中。经ＤＮＡ序列测定,确定０．４４ｋｂ的ＰＣＲ产物合完整的编码人白细胞介素－３成熟蛋白ｃＤＮＡ序列,并在信号肽与成熟蛋白编码序列之间通过突变引入了限制性内切酶位点和ＡＴＧ起始密码。构建的ＰＬ启动子控制下的ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ表达质粒,转入大肠杆菌Ｔａｐ１０６,经４２℃热诱导,获得ｈＩＬ－３的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为１５ｋｄ,约占细菌总蛋白的１５％。表达产物经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证。ｈＩＬ－３表达产物在细胞内形成包涵体,纯化包涵体,使产物纯度提高到７０．８％,产物复性后,能明显促进ｈＩＬ－３依赖细胞株生长,具有明显的生物活性。产物转移到ＰＶＤＦ膜后进行Ｎ端序列分析,Ｎ端１６个氨基酸正确。     

雄激素受体融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与纯化

将雄激素受体的ｃＤＮＡ片段克隆到表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ内,在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,得到可溶性表达产物ＧＳＴ－ＡＲ。用该融合蛋白制得的兔多克隆抗体,经ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ亲和吸附纯化后,表现出较好的抗ＡＲ的专一性,可用于ＡＲ结构和功能的研究。     

一种与Calpastatin具有部分同源结构的人精子膜蛋白的发现与研究

在以前工作中我们从人精子中分离纯化出一种与生育有关的糖蛋白,命名为ＢＳ－１７。本文用其多克隆抗血清从人睾丸λｇｔ１１ｃＤＮＡ表达库中克隆了编码ＢＳ－１７的ｃＤＮＡ片段。序列分析表明ＢＳ－１７ｃＤＮＡ片段长７９１ｂｐ,开放阅读框架５５８ｂｐ,可编码１８６个氨基酸。经数据库检索,该ｃＤＮＡ片段与人Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ（Ｃａ￣（２＋）依赖的半胱氨酸蛋白酶ｃａｌｐａｉｎ抑制剂）基因３’端顺序具有９９．７％的同源,与Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ蛋白质羧基末端同源性为９９．５％。用ｃＲＮＡ进行组织原位杂交结果表明,ＢＳ－１７基因表达于人精子减数分裂后期单倍精细胞阶段。     

雄激素受体与雄激素应答元件的相互作用

将雄激素受体（ＡＲ）的ｃＤＮＡ１１１９ｂｐ片段（１１０５－２２２４）（其中包含其ＤＮＡ结合结构域到部分激素结合结构域）克隆于表达南粒ｐＧＥＸ中,通过ＩＰＴＧ诱地,在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达ＧＳＴ－ＡＲ融合蛋白,经谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ亲和层析得以部分纯化。利用一个有雄激素应答元件（ＡＲＥ）活性的Ｃ３（１）ＤＮＡ片段为阳性探针,通过凝胶阻滞分析和ＤＮａｓｅ１足迹法证明此表达产物具有牧民的ＤＮＡ     

一种与Calpastatin具有部分同源结构的人精子膜蛋白的发现与研究

在以前工作中我们从人精子中分离纯化出一种与生育有关的糖蛋白,命名为ＢＳ－１７。本文用其多克隆抗血清从人睾λｇｔ１１ｃＤＮＡ表达库中克隆了编码ＢＳ－１７的ｃＤＮＡ片段。序列分析表明ＢＳ－１７ｃＤＮＡ片段长７９１ｂｐ,开放阅读框架５５８ｂｐ,可编编码１８６个氨基酸。经数据库检索,该ｃＤＮＡ片段与人Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ蛋白质羧基末端同源性为９９．５％。用ｃＲＮＡ进行组织原位杂交结果表明,ＢＳ－１７基因     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达

将抗真菌蛋白Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２全长ｃＤＮＡ插入表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ／ＮｃｏＩ＋ＳａｃＩ位点,构建成融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ１和ｐＲＡＦ２．将不含信号肽编码序列的Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２ｃＤＮＡ分别插入ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｃｏｌ＋Ｓａｃｌ和ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｄｅｌ＋ＳａｃＩ位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ３、ｐＲＡＦ４和非融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ５和ｐＲＡＦ６．将构建的上述各种表达载体转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,挑菌落培养,ＩＰＴＧ诱导,使Ｒｓ－ＡＦＰｓ基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,ｐＲＡＦ３和ｐＲＡＦ４表达产物的抑菌活性较明显．     

鼠Ⅰ型可溶性白细胞介素1受体基因在昆虫细胞的克隆和表达

白细胞介素１（ＩＬ－１）是一种重要的细胞因子,具有广泛的生物学活性。它通过与细胞表面的白细胞介素 １受体（ＩＬ－１Ｒ）结合而起作用。以杆状病毒为载体在昆虫细胞中克隆表达了小鼠Ｉ型可溶性白细胞介素１受体（ｓＩＬ－１　ＲＩ）基因。以ＮＩＨ／３Ｔ３细胞ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到小鼠ｓＩＬ－ＩＲＩ的ｃＤＮＡ,克隆至杆状病毒转移载体ｐＡｃＧＰ６７Ｂ,将转移重组质粒与野生病毒ＡＣＮＰＶ ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,经同源重组得到重组杆状病毒ｒＡＣＮＰＶ。应用经纯化的ｒＡｃＮＰＶ感染昆虫细胞Ｓｆ９,表达获得重组的ｓＩＬ－１ＲＩ。经对亲和层析样品的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析和对ＩＬ－１β生物活性阻断作用实验证实,表达产物能够与其配基结合,并且能够分泌至细胞培养上清中。     

人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定

通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒 (命名为pTCKA′) .将其转化BL2 1(DE3)菌 ,IPTG诱导后未见高效特异表达 .然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体 ,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达 .Western印迹结果证明 :该蛋白能与兔抗人CK2α′3 3 3 3 50 肽段抗血清发生特异性免疫反应 .采用GSH Sepharose 4B柱纯化 ,凝血酶酶切 ,最后从 4g细菌获 4 4mg纯化重组蛋白 .通过性质鉴定和酶动力学分析证明 :克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基 .     

重组人白细胞介素11在毕氏酵母中的表达

将人白细胞介素11基因选用酵母偏爱密码子人工合成全基因,克隆到酵母分泌型表达载体pGENYk中,酶切线性化后原生质体转化导入酵母细胞进行整合,G418筛选得到多拷贝转化子,甲醇诱导表达,纯化制备产物,经过SDS－PAGE、Western印迹及体内外生物学活性等分析表明,产物活性与E.coli融合表达的Neumega一致。     

人白细胞介素11融合蛋白切割位点的改变及成熟蛋白的纯化

将 h IL- 1 1 c DNA克隆入硫氧还蛋白基因融合表达载体 p TRXFUS的 trx A基因 3′末端 ,构建符合读码框的融合基因 ,并在两基因间改变原有的肠激酶切割位点 ,引入蛋白质的羟胺切割位点序列 ,该融合蛋白在大肠杆菌中表达量达 2 0 %以上 .经羟胺切割 ,柱层析等纯化步骤后 ,得到纯度98%以上的成熟 h IL - 1 1 .用 IL- 6依赖细胞株 7TDI及 MTT法测定生物学活性 ,比活达 8× 1 0 6 IU/mg.并对纯品进行了 Western blot,N端 1 5个氨基酸测序及 h IL- 1 1氨基酸组成等分析和鉴定     

人白细胞介素-11基因在家蚕培养细胞和虫体内的表达

将缺少编码信号肽序列的人白细胞介素－11（hIL-11)546核苷酸cDNA,重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacIL-11,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒（BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株BmN,获得了插入hIL-11基因的重组病毒。Southern杂交表明重组病毒基因组中含有hIL-11基因片段,RNA斑点杂交表明hIL-11基因得到了转录。重组病毒感BmN细胞株、家蚕幼虫和蛹,在细胞培养上清、细胞抽提物、幼虫和蛹的体液样品中,SDS－PAGE电泳分析都能检测得到表达产物的特异性条带;采用IL－11依赖细胞株B9－11和MTT法测定表达产物的生物活性,表明rIL-11基因分别在培养细胞和蚕体内得到了高效表达。     

Cytoplasmic and periplasmic expression of a highly basic protein,human interleukin 4, inEscherichia coli

Summary Human IL-4 (hIL-4) has been cloned from a human T cell line based on its homology to the murine IL-4 cDNA sequence [36]. We have compared cytoplasmic and extra-cytoplasmic expression of this basic protein inEscherichia coli using various combinations of promoters, replicons and host strains. Strains producing a cytoplasmic product were most successful at heterologous protein expression, producing up to 500 mg/l of an inactive aggregated form of the protein. The biological activity of the protein could be restored by refolding the protein with guanidine hydrochloride and glutathione giving a specific activity identical to that of IL-4 derived from CHO cell lines stably transformed with an hIL-4 expression plasmid. Strains designed to secrete human IL-4 into the periplasmic space produced far less protein (approximately 5 mg/l). However, a significant fraction of this protein was detected in the culture medium. This fraction appeared to be soluble after ultracentrifugation, and demonstrated high specific activity without refolding. Leakage of heterologous protein into the culture medium may be a viable way to recover biologically active products without relying on the denaturation and refolding in vitro that can, at times, yield incorrectly folded gene product.     

人TRAIL基因cDNA的克隆及其在COS—7细胞中的表达

ＴＲＡＩＬ(ＴＮＦｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ)是最近克隆的肿瘤坏死因子(ＴＮＦ)家族的新成员,由于它的蛋白质结构和生物学效应类似于ＦＡＳ/ＡＰＯ1Ｌ,因此,也被称为ＡＰＯ2Ｌ。在低浓度下,ＴＲＡＩＬ能迅速地诱导多种肿瘤细胞系的?..     

Cloning and expression of feline interleukin 15

A cDNA encoding feline interleukin 15 (IL15) was cloned from the lymph node of a cat infected with feline infectious peritonitis virus. The cDNA is 486 bp in length and encodes a protein of 162 amino acids. Recombinant protein was readily expressed as a GST fusion in Escherichia coli and purified by glutathione affinity chromatography. Expression of recombinant protein in mammalian cells was only accomplished by eliminating the 5' and 3' UTR, replacing the IL15 signal peptide with the tissue plasminogen activator signal peptide, and adding 3' sequence to disrupt presumptive secondary structure of the mRNA. Biologically active feline IL15 was expressed in HEK293T cells and was shown to sustain primary feline lymphocytes, a feline T cell line, and mouse CTLL-2 cells. Proliferation of CTLL-2 cells was induced by the recombinant protein in a dose-dependent manner. Monoclonal and polyclonal antibodies against human IL15 recognized feline IL15 in immunofluorescence and Western blot assays. Additionally, feline IL15 was detectable using a commercially available human IL15 ELISA kit.     

Isolation of an evolutionarily conserved epidermal growth factor receptor cDNA from human A431 carcinoma cells

Complementary DNA corresponding to total poly(A)+-RNA from the human A431 epidermoid carcinoma cell line was cloned in the phage expression vector lambda gt 11. An epidermal growth factor (EGF) receptor cDNA clone was obtained by screening of the expression library with a rabbit polyclonal antibody (IgG), raised to the purified A431 EGF receptor, in combination with [125I]protein A of S. aureus. The cloned cDNA was able to select, by hybridization, messenger RNA which was translated in Xenopus oocytes and yielded an immunoprecipitable EGF receptor protein of Mr = 160,000. The insert of this cDNA (phEGFR-1), is approximately 880 base pairs in length and encodes the carboxyterminal portion of the EGF receptor protein. Its sequence is evolutionarily conserved among vertebrates as shown by hybridization to unique chromosomal DNA sequences from human, baboon, dog, rat, mouse and frog.     

可溶性人TRAIL分子的制备及其抗肿瘤活性

TRAIL(TNF relatedapoptosis inducingligand)是1 995年发现的一个新的TNF超家族成员.使人感兴趣的是该分子既可广泛介导多种组织来源的肿瘤细胞发生凋亡而基本不影响正常细胞的功能,也可引起许多对于FasL和TNF α有抗性的细胞凋亡[1 ,2 ] .因此,有可能成为一种新的抗肿瘤药物.