贾第虫同工酶研究进展

Bertram等(1983)首次应用淀粉凝胶电泳技术开展了蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia Lamblia简称贾第虫)同工酶的研究工作。此后,这一领域的研究一直受到人们的重视,而且进展很快。现将近年来这方面的研究做一概述。 (一)贾第虫同工酶与虫株致病性的关系人体感染贾第虫后,临床症状表现如腹痛、     

从基因组分析贾第虫的核糖体合成系统

为探讨贾第虫细胞核内核糖体合成系统,及与典型的真核生物有何差异,首先,确定在典型真核生物中参与核糖体合成的129条共有的保守蛋白,然后用这些蛋白搜索贾第虫基因组以调查它们在贾第虫中的直系同源蛋白的情况,以对贾第虫的核糖体合成系统作一了解。结果表明：贾第虫具有89条这些蛋白的直系同源蛋白,包括参与rRNA甲基化和假尿嘧啶化的蛋白复合体成员,以及存在于90S、40S和60S复合体中的蛋白。贾第虫的核糖体合成系统与典型的真核生物相似,但还有40条蛋白在贾第虫基因组中找不到同源蛋白。这意味着贾第虫的核糖体合成系统较典型的真核生物简单。贾第虫虽然没有核仁结构,但其核糖体亚基合成的途径和机制可能与真核细胞相似,参与的成分不同于无核仁结构的原核生物,可能相对简单。     

蓝氏贾第虫组蛋白的初步研究

本文初步比较分析了贾第虫组蛋白的存在及其基本组成。通过甲醇固定,两次０．３ｍｏｌ／ＬＨＣｌ抽提及丙酮沉淀,提取贾第虫酸溶性蛋白,利用亲和层析制取总ＤＮＡ结合蛋白,经酸性尿素系统及ＳＤＳ系统电泳分析表明,贾第虫已存在５种组蛋白,其在两种不同性质电泳系统中的电泳行为与相应的小牛胸腺组蛋白有近似的对应关系。说明贾第虫的组蛋白已发生了分化,并已初步形成了性质不同的几个组份,从而在一定程度上支持核小体组蛋白在真核生物的原核祖先阶段就已产生了分化的假说。     

生物素标记DNA探针杂交条件探讨

DNA探针技术正越来越广泛地应用于医学基础研究和临床检测.生物素标记探针已在某些领域部分取代同位素标记探针而发挥作用。杂交是DNA探针技术中重要一环.各种杂交条件的变化均会对杂交结果并最终对检测结果产生影响。文献中关于杂交条     

光敏生物素标记法制备HPV DNA探针

本文将PBR322与HPV重组质粒DNA转化大肠杆菌HB101株,经氨苄青霉素—四环素平板筛选转化成功的菌落,将其扩增、提取质粒DNA,纯化后用限制性内切酶酶切,琼脂糖凝胶电泳区分不同大小的限制性内切片段,并用电洗脱法回收7.9Kb的HPV DNA片段。在高能卤素灯光照下标记光敏生物素制备HPV DNA探针,并检测其特异性和敏感性。结果表明:此探针具有较高敏感性,可达2.5pg;并且具有较强的特异性。     

蓝氏贾第虫无义mRNA的降解

无义介导的mRNA降解途径（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）作为细胞内的一种重要的mRNA质量监控机制,可以降解含有提前终止密码子（premature termination codon,PTC）的异常转录本,从而避免截短蛋白质对细胞的毒害,但其详细的分子机制有待进一步阐释。蓝氏贾第虫（Giardia lamblia)作为一种寄生性单细胞原生动物,进化地位特殊,对其NMD途径的研究有利于阐明基因表达调控的分子和进化机制。本研究通过酵母双杂交及体外pull-down实验分析了贾第虫NMD途径因子上游移码蛋白1(Giardia lamblia up-frameshift 1,GlUPF1)、贾第虫RNA结合蛋白（Giardia lamblia HRP1, GlHRP1）、贾第虫核糖核酸外切酶（Giardia lamblia Ski7p,GlSki7p、Giardia lamblia XRN1,GlXRN1）之间的相互作用关系。结果表明,GlUPF1全长与GlHRP1、GlXRN1(1~500 aa)、GlSki7p间均可发生相互作用。而且GlUPF1的CH结构域和C端结构域分别与GlHRP1、GlXRN1（1~500 aa）、GlSki7p相互作用。说明GlUPF1在贾第虫NMD途径中作为招募平台,在无义mRNA识别和降解过程中发挥重要作用。为此,结合本实验室之前的研究结果,我们提出原生动物贾第虫的NMD途径：在提前终止密码子处SURF(SMG1-UPF1-eRF1-eRF3)复合物形成后,GlUPF1被磷脂酰肌醇3-激酶(suppressor with morphogenetic effect on genitalia 1,SMG1)磷酸化修饰, NMD途径激活,随后GlUPF1与HRP1相互作用,将转录本标记为NMD底物;GlUPF1进而招募下游贾第虫5′-3′核糖核酸降解酶GlXRN1、贾第虫3′-5′ 核糖核酸降解因子GlSki7p,最终降解靶标mRNA。     

源真核生物蓝氏贾第虫核分裂的初步观察

贾第虫属于源真核生物（Ａｒｃｈｅｚｏａ）中的双滴虫门,是目前所知的最低等的真核生物。本工作首次对蓝氏贾第虫（Ｇｉａｒｄｌｉａｌａｍｂｌａ）的核分裂作了初步的电镜观察,未能在分裂着的核中见到纺锤体或纺锤体微管。以０．１—２０μｇ／ｍｌ浓度的秋水仙素作实验,其核分裂也不受阻抑。以抗微管蛋白的多抗作免疫荧光检查,也未见分裂着的核中有微管蛋白。这似乎意味着其核分裂方式乃是前有丝分裂性质的。对此进行了讨论。     

全基因组DNA顺序测定

自１９２６年摩尔根《基因论》发表以来，许多遗传学工作者都在寻找基因的化学实体，到１９２８年格里菲斯（Ｇｒｉｆｉｔｈ）和１９４４年埃弗里（Ａｖｅｒｙ）的转化实验，才首次证明了基因的本质是ＤＮＡ，基因是ＤＮＡ分子上的功能单位。１９５３年沃森（Ｗａｔｓｏｎ...     

酶标DNA探针与Y染色体DNA的探测

 用辣根过氧化物酶标记DNA的技术,制备了酶标基因探针。研究了酶标过程和产物的电泳行为;用斑点杂交和southern印迹杂交探测了单链、双链DNA,灵敏度可达pg水平,以此酶标的Y染色体特异的DNA片段作探针,进行了DNA杂交的性别分析,证明该探针能清楚地区别两性基因组DNA,这对基因的研究和诊断有一定实用价值。     

应用聚合酶链式反应扩增和光敏生物素标记的cDNA探针检测马铃薯纺锤块茎类病毒

以含马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTV)RNA的总核酸为模板,加入人工合成的互补DNA引物,用反转录酶合成PSTV cDNA;在聚合酶链式反应系统中,用两个PSTV特异性引物进行cDNA扩增,用以制备光敏生物素标记的PSTV cDNA探针。用此探针进行斑点杂交检测含PSTV的马铃薯核酸提取液和汁液均出现阳性杂交信号,而健康马铃薯的核酸提取液和汁液的结果均为阴性。光敏生物素标记探针检测纯化PSTV的灵敏度可达5pg;检测感染PSTV的马铃薯块茎汁液的可测出最高稀释度为1:400。     

一种能表现水稻基因组DNA分化特征的重复DNA顺序

用ＤＮＡ 复性动力学方法克隆到一个水稻中度重复顺序。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交、限制性内切酶分析及序列分析资料表明,该重复顺序在水稻基因组中具有串联重复和散布状态两种存在方式。以该ＤＮＡ 片段作探针,用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交方法分析了多种野生稻种和栽培稻品种的基因组分化特征。某些限制性内切酶消化过的水稻ＤＮＡ,其图谱呈现出多达４０ 条以上的杂交带,包括强杂交带和弱杂交带两种类型。重复实验结果证明,强杂交带表现为ＢＢＣＣ染色体组型特异而弱带则在栽培稻各品种间显示出丰富的多态性,表明该重复顺序片段在水稻理论研究和育种实践中可能具有重要意义     

大熊猫基因指纹探针F2ZGP96060801的研制及比较实验分析

利用ＡＢＩ－３９４型ＤＮＡ合成仪合成的寡核苷酸５－「Ａ（Ｘ）ｎ－ｘＴＣＣＡＣ」ｎ－３,经高效液相色谱仪纯化后,制备成了命名为为Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１的大熊猫基因指纹探针,用同位素标记法标记Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１,ＬＺＦ－Ｉ、朋５、３３．６和（ＣＡＣ）６／ＧＴＧ）５等５种基因指纹探针,比较检测了大熊猫随机个体的被毛、大熊猫３雄配Ｉ雌所产１个双胞胎计６只个体的福尔马林固定的肝组织和粪便中的胃肠     

CONSTRUCTION AND PRIMAL APPLICATION OF A CLONED DNA PROBE FOR OEDALEUS ASIATICUS ENTOMOPOXVIRUS

Abstract  One fragment of the Oedaleus asiaticus entomopoxvirus (OaEPV) DNA cleaved with Bgl I was cloned into the EbmHI site of GEM-7zf(+) and then labeled by random oligonucletide primer to be a cloned DNA probe. This probe had species specificity to Dociostaurus kruussi EPV and Nosema to custae , but not to Calliptomus italicus EPV. The probe was able to detect Ing OaEPV DNA, 10² viral spheroids and OaEPV in the infected grasshopper homogenates.     

亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus痘病毒DNA探针的构建和初步应用(英文)

用限制性内切酶酶切亚洲小车蝗痘病毒DNA,将酶切后的DNA片断克隆到质粒pGEM—7zf( )中。用随机引物法标记克隆的外源亚洲小车蝗痘病毒DNA片断为探针。经Southern及斑点杂交证明此探针对新疆戟纹蝗Dociostaurus kraussi及微孢子虫Nosema locusstae有特异性,对新疆意大利蝗Calliptomus italicus无特异性。构建的探针可检测1ng亚洲小车蝗痘病毒DNA及10~2病毒包含体,也可检测感染病虫匀浆液中的痘病毒。     

丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性,以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制,打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化,对治疗的评价,以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。     

离子束介导甘蓝全DNA转化拟南芥菜的分子分析

30 keV的Ar+离子束在1.5×1017 ions/cm2的注入剂量下介导外源甘蓝全DNA导入模式植物拟南芥菜,在94株转化当代植株中,有6株表型产生变异。以其中的一株(T-5)作为研究对象,用80条10碱基随机引物对该株和其子代变异株基因组作随机扩增的多态性DNA分析,引物S176 在T-5和其变异子代T-5-2中扩增出了相同分子量的变异新条带T-5S176-620。T-5S176-620的碱基序列和拟南芥菜基因组序列进行同源比对,结果表明该片段不属于拟南芥菜基因组,Southern杂交实验证明该片段来自供体甘蓝基因组。但是,根据T-5S176-620序列设计的引物不能从甘蓝基因组中扩增出预期长度的DNA片段,结合离子束介导外源全DNA转化的特点和过程,探讨了其中可能的机制。     

IDENTIFICATION OF THE TOXIC DINOFLAGELLATES ALEXANDRIUM CATENELLA AND A. TAMARENSE (DINOPHYCEAE) USING DNA PROBES AND WHOLE-CELL HYBRIDIZATION1

Fluorescent DNA probes (cCAT-F1 and cTAM-Fl) complementary to the 3′ end of ribosomal RNA (rRNA) internal transcribed spacer 1 sequences (ITS 1: positions 154–176) of toxic species of Alexandrium catenella (Whedon and Kofoid) Taylor and A. tamarense (Lebour) Taylor were applied to various cultures of the genus Alexandrium and several other phytoplankters using whole-cell fluorescent in situ hybridization. cCAT-F1 and cTAM-F1 reacted with targeted strains of A. catenella (catenella type) and A. tamarense (tamarense type), respectively, and did not react with isolates of A. affine (Inoue et Fukuyo) Balech, A. fraterculus (Balech) Balech, A. insuetum Balech, A. lusitanicum Balech, A. pseudogonyaulux (Biecheler)Horiguchi ex Yuki et Fukuyo comb. nov., nor isolates of Prorocentrum micans Ehrenberg, Amphidinium carterae Hulburt, Heterocapsa triquetra (Ehrenberg) Stein, Gymnodinium mikimotoi Miyake et Kominami ex Oda, Skeletonema costatum (Greville) Cleve, Heterosigma akashiwo (Hada) Hada, and Chattonella antiqua (Hada) Ono. DNase I and RNase A treatment showed that probes hybridized to ribosomal DNA, not rRNA. Probes were localized at the bottom of the U-shaped nucleus, a region that corresponds to the nucleolus. The probes are highly specific for particular strains of A. catenella and A. tamarense and are applicable for identifying these species collected from cultured and possibly natural populations.     

原位缺口平移标记断裂DNA技术及其在检测流行性出血热尸检和实验动物组织中细胞凋亡和早期死亡的应用

原位缺口平移技术（ＩＳＮＴ）已被用于检测细胞核中ＤＮＡ断裂鉴别尸检组织中细胞的凋亡和坏死断裂、流行性出血热（ＥＨＦ）组织中存在散在单个细胞变性死亡和灶性梗死样坏死,前者带有细胞凋亡的特征。本文以ＥＨＦ肝脏和实验性病毒感染鼠脑组织为例,应用缺口平移法,在ＤＮＡ聚合酶或Ｋｌｅｎｏｗ酶的作用下,将地高辛标记的ｄＵＴＰ掺入合成到ＤＮＡ的断裂部位,通过碱性磷酸酶标抗地高辛抗体免疫组化法显示细胞ＤＮＡ的断裂,检测和鉴别细胞的凋亡和坏死。为分析死后解剖时间间隔及组织固定时间对该方法的影响,本文选用死后２～１４０ｈ尸检、经常规固定石蜡包埋后存放１０～３５年的标本和在１０％福尔马林固定了１０～３５年之后再进行常规处理的标本。实验时用蛋白酶Ｋ（ＰＫ）消化前后对比并分别在标记反应液中略去ＤＮＡ聚合酶作为阴性对照,用ＤＮＡ酶消化组织人为制造ＤＮＡ缺日作为阳性对照。结果发现,未经ＰＫ消化的组织,仅灶性肝细胞核ＩＳＮＴ标记阳性,经ＰＫ消化后,散在的带有凋亡特征的肝细胞胞核也出现阳性,灶性肝细胞胞核标记染色增强,但无论是蛋白酶消化与否,明确梗死样坏死的肝细胞均不被标记。结果还发现,死后２～２４ｈ内尸检组织和长时间（１０～３４年）存放的石