大熊猫犬瘟热病毒融合蛋白基因3‘端的序列测定

从死亡大熊猫的肝脏中直接提取细胞总ＲＮＡ,经反转录后,用犬瘟热病毒的两对引物,分两段扩增出融合蛋白基因３＇端的片段。经序列分析表明：此片段的长度为６９３ｂｐ;此毒株在核苷酸和氨基酸水平与某疫苗弱毒株、Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株、海豹瘟热病毒２型毒株和海豹瘟热病毒１型的同源性分别为９７．５％和９６．２％、８８．６％和９４．５％、９２．９％和９５．６％、６３．２％和７６．５％;大熊猫毒株与其它毒     

大熊猫和小熊猫犬瘟热病与疫苗免疫现状

犬瘟热病(Canine Distemper)是由犬瘟热病毒(CDV)引起敏感动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。在临床上以双相热、卡他性鼻炎以及随后引起支气管炎、卡他性肺炎、严重胃肠炎和神经症状等为主要特征,发病率几乎达100%,死亡率达50%~80%,素有“毁灭性传染病”之称[1~3]。该病最早发现于18世纪后叶,1905年Carre氏发现其病原为病毒,因而本病又名Carre氏病。病原为副粘病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒,属于RNA病毒,呈球形,大小为150~300 nm[2,3]。一般认为CDV只有一个血清型。但近年的研究表明该病毒出现了变异毒株[4~10]。目前本病分布于世界各地。其发病率和死亡率在敏感动物各科之间以及同科之间存在较大的差异,如该病对雪貂的致死率接近100%,而对家犬的致死率则在50%~70%之间[11~13]。除犬科动物、鼬科、浣熊科等动物高度易感外,犬瘟热病毒对大熊猫和小熊猫也高度易感,并且已成为威胁大熊猫和小熊猫种群数量和生命安全的第一大烈性传染病[11,14~19]。至今为止,对于该病的防治措施除采用疫苗进行定期的免疫接种加以预防外,全球范围内尚无特异性治疗方法[11]。然而,...     

犬瘟热弱毒疫苗对大熊猫的免疫效果评价

以国产犬用犬瘟热等六联弱毒苗接种33只不同性别、不同年龄的健康大熊猫,分别采集每只大熊猫免疫前以及免疫后2周、1个月、3个月、6个月、9个月、11个月的血清样品,采用细胞中和试验测定犬瘟热病毒(CDV)中和抗体效价,并对接种疫苗后的所有大熊猫个体进行连续1年的健康资料记录.结果表明,所有接种疫苗的大熊猫均未出现任何与疫苗相关的副反应,该疫苗接种对大熊猫是安全的;部分老年、成年和亚成年的大熊猫(13/33)在疫苗接种前已经存在CDV抗体(≥1:4);2只老年大熊猫在疫苗接种后仅产生低水平的CDV抗体(≤1:8),另外2只老年大熊猫在疫苗接种后未产生CDV抗体(＜1:4);部分成年大熊猫(9/15)在疫苗接种后未产生CDV抗体(＜1:4),仅部分成年大熊猫(6/15)在疫苗接种后产生低水平的CDV抗体(≤1:22);部分亚成年大熊猫(8/9)在疫苗接种后能够产生低水平的CDV抗体(≤1:22),少数亚成年大熊猫(1/9)在疫苗接种后未产生CDV抗体 (＜1:4);幼年大熊猫(5/5)疫苗接种后可产生CDV抗体,2周至1月内达到高峰,CDV抗体水平和持续时间都明显高于老年、成年和亚成年大熊猫(P＜0.05);少数幼年大熊猫(1/5)疫苗接种后CDV抗体达到1:127,但3个月后所有幼年大熊猫CDV抗体就陡然下降(≤1:16).由此表明,在现有的免疫剂量和程序下,犬用犬瘟热等六联弱毒疫苗难以有效刺激大熊猫产生CDV中和抗体.     

大熊猫犬瘟热病毒融合蛋白基因3′端的序列测定

从死亡大熊猫的肝脏中直接提取细胞总ＲＮＡ,经反转录后,用犬瘟热病毒的两对引物,分两段扩增出融合蛋白基因３′端的片段。经序列分析表明：此片段的长度为６９３ｂｐ;此毒株在核苷酸和氨基酸水平与某疫苗弱毒株、Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株、海豹瘟热病毒２型毒株和海豹瘟热病毒１型的同源性分别为９７．５％和９６．２％、８８．６％和９４．５％、９２．９％和９５．６％、６３．２％和７６．５％;大熊猫毒株与其它毒株融合蛋白３′端疏水性和二级结构均有一定差异;其非编码区比国外报道的Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株多９个碱基,在非编码区最后５８个碱基,两毒株仅有１７个相同。至于这种差异的生物学意义尚待进一步的研究     

显示SARS病毒包涵体的技术探讨

SARS病毒包涵体是一种非常微小的微生物 ,在一般的情况下用光学显微镜是不易被发现的 ,但当它侵及细胞并形成小体时 ,则可用光学显微镜来检测 ,但较难寻找。为了寻找较有效的病毒包涵体染色方法来显示SARS病毒包涵体 ,我们对现有的病毒染色法如Macchiavello氏法的改良法、Mann氏法、Lendram氏法进行对照应用 ,经实验认为 ,Macchiavello氏的改良法效果最好 ,该法应用省时、易操作 ,可将病毒包涵体显示为鲜红色。至今为止 ,认为引起SARS的病毒是变性的冠状病毒 ,但由于该病毒非常微小 ,必须依靠电镜才能对其进行鉴定和鉴别。由于进入细…     

牛呼吸道合胞体病毒G蛋白的截短表达与鉴定

经生物学软件DNA Star分析,将牛呼吸道合胞体病毒G基因截短成2个片段G1和G2。然后用人工合成的牛呼吸道合胞体病毒G基因为模板,用PCR分别扩增G1和G2基因片段,其大小分别为570 bp和308 bp。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导后G1和G2基因片段都获得了表达,且都为可溶性表达。用Ni柱亲和层析法在非变性条件下纯化重组蛋白,经免疫印迹试验鉴定证明纯化的重组蛋白G1具有良好的抗原性和特异性,而重组蛋白G2无反应性。应用纯化的重组蛋白G1进行的间接ELISA与免疫印迹试验在国内牛血清中检测到了BRSV血清抗体。本研究所表达的重组蛋白G1为基于牛呼吸道合胞体病毒G蛋白的血清学诊断方法的建立与牛呼吸道合胞体病毒G蛋白生物学功能的研究奠定了基础。     

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白聚集体特性及与其它包涵体蛋白的血清学关系

纯化的多角体碱解释放多角体蛋白,经等电点沉淀和柱层析对多角体蛋白进行分离纯化,结合SDS-PAGE、免疫双向扩散、免疫电镜等方法,证明棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)的多角体蛋白以聚集体形式存在。用ELISA法检测包涵体蛋白之间的血清学关系,结果表明,与黄地老虎颗粒体病毒(AsGV)和粘虫颗粒体病毒(PsGV)颗粒体蛋白相比较,HaNPV多角体蛋白与葡萄天蛾核型多角体病毒(ArNPV)和黄地老虎核型多角体病毒(AsNPV)多角体蛋白之间的血清学关系更为密切。     

大熊猫脐带间充质干细胞外泌体的分离鉴定及miRNAs富集分析

大熊猫脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)通过旁分泌所释放的外泌体在大熊猫保健与疾病治疗方面具有一定的应用前景。本研究旨在建立大熊猫UC-MSCs外泌体分离方法,开展生物学特征分析和分子鉴定,并研究UC-MSCs外泌体中miRNAs的种类与功能。采用超速离心法从大熊猫UCMSCs培养上清中成功分离外泌体,通过透射电子显微镜进行形态学观察,纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径大小,蛋白免疫印迹法检测特异性分子标记表达。采用Small RNA测序技术对UC-MSCs外泌体中的miRNAs进行鉴定,并对其靶基因进行了预测与功能分析。结果显示,大熊猫UC-MSCs外泌体呈圆形杯托状结构,直径为(79.15±4.81) nm,外泌体标志蛋白CD81与TSG101呈阳性表达而CALNEXIN呈阴性表达。大熊猫UC-MSCs外泌体中的miRNA主要为miR-148-3p (30.28%)与miR-21-5p (21.72%)。本研究首次从大熊猫UC-MSCs培养上清中分离出外泌体,并对其所含的miRNAs进行富集分析及功能预测,为大熊...     

Beagle犬免疫血清犬瘟热抗体检测

采用琼脂扩散法测定血清抗体效价,同时采用微量细胞中和实验测定中和效价,检测60份Beagle犬免疫血清犬瘟热(CD)抗体.结果表明25日龄仔犬血清母源抗体维持在较高的水平,以后逐渐下降,至35日龄(首免日)血清母源抗体水平下降1～2个滴度,首免后1个月、3个月、6个月免疫抗体水平逐渐上升.根据抗体水平应选择35日龄首免.本试验为 Beagle犬瘟热病预防选择疫苗和制定合适的免疫程序提供参考,实验设定的两种免疫程序在临床上都可以使用.     

用单克隆抗体结合酶联免疫吸附试验检测云杉卷叶蛾幼虫体内的核多角体病毒

在ELISA间接法中,应用单克隆抗体检测感染云杉卷叶蛾核型多角体病毒(Choristoneura fumiferana nuclear polyhedrosis virus,CfNPV)的云杉卷叶蛾幼虫体内多角体蛋白和病毒粒子。三龄幼虫喂饲表层涂有CfNPV的人工饲料(2×10~5PIB/cm~2)后6小时,即可在幼虫抽提液中检出多角体蛋白抗原(每条幼虫含0.14μg)和病毒粒子抗原(每条幼虫含0.32μg),随后此两种抗原量逐渐增加,直至第5天。而用染色涂片镜检法,则在添食病毒后3天才可观察到有少量多角体,病虫的病症需5～6天后才出现。因此,本法是一种快速、特异和敏感的检测杆状病毒的方法,其敏感度为1ml含10ng提纯的病毒粒子或多角体蛋白都能被检测出来。     

大熊猫出生体质量分类的初步探究

以成都大熊猫繁育研究基地的192只大熊猫Ailuropoda melanoleuca活体幼仔为研究对象,分析大熊猫出生体质量的统计学分布特点.结果显示,大熊猫出生体质量主要分布在[100,210),且处于[100,110)和[200,210)区间的个体频率也较高,而出生体质量低于60 g的幼仔个体极少;因此,根据大熊猫...     

雌性大鼠结膜、睑板腺组织中肥大细胞的分布及形态学研究

目的:研究雌性大鼠结膜、睑板腺组织中肥大细胞的形态及分布.方法:用HE染色和改良甲苯胺蓝染色方法.结果:肥大细胞在穹隆结膜和睑结膜的固有层均有分布,细胞形态多样,大小不等,以圆形、卵圆形为多见,尚可见少量梭形、锥形;穹隆结膜的肥大细胞数量较睑结膜多.睑板腺组织中肥大细胞分布在被膜和相邻腺泡间质内,被膜内的肥大细胞以梭形、卵圆形为主,细胞长轴沿被膜平行排列;相邻腺泡间质中的肥大细胞以圆形、卵圆形或不规则形为主.可见少数相邻肥大细胞借胞体的突起互相连结.结论:为进一步探讨肥大细胞在结膜、睑板腺组织中的生物学作用以及眼表疾病的发生机制奠定了基础.     

流行性出血热病人尸检材料中的病毒包涵体

应用抗流行性出血热病毒多克隆及单克隆抗体结合敏感的方法在尸检组织切片上进行了免疫细胞化学染色,多克隆抗体可清楚地显示出尸检组织中病毒抗原阳性的包涵体结构。依光镜下染色的形态特点不同,可将包涵体分为四个类型即小泡型、大泡型、多泡型和实心型。单克隆抗体染色进一步证实,实心型及空泡型包涵体呈“N”抗原阳性,少数组织中空泡状包涵体也呈“G2”抗原阳性。病毒包涵体的出现可作为该病毒在人体细胞内感染及复制的形态学证据。     

包涵体——犬传染性肝炎病毒形态发生学的重要特征

用免疫金电镜技术和电镜原位杂交技术观察了犬传染性肝炎病毒感染的犬肾传代细胞中的病毒包涵体,发现这些包涵体具有以下三种基本形态：1．松散均质包涵体;2．副结晶色包涵体;3．致密颗粒包涵体。其中前二种包涵体能被免疫金标记,它们是尚未成病毒粒子的病毒蛋白或是病毒装配后乘余的病毒蛋白,后一种包涵体能被病毒DNA探针标记,是病毒核酸合成过剩而堆积起来形成的产物。此外,本文还描述和讨论了包涵体与细胞及病毒发育成熟的关系。     

大菜粉蝶颗粒体病毒的研究:包含体结合的碱性蛋白酶

本文报道从新疆分离的一株大菜粉蝶(Pieris brassicae)颗粒体病毒(PbGV)包含体上结合有碱性蛋白酶.提取含酶的包含体蛋白,以酪蛋白为底物鉴定表明此酶在pH9.4有最大的酶活力,并定位于“包裹”在病毒粒子套膜外的包含体蛋白中.在高pH时分子皿为26,500的包含体蛋白被酶降解为19,500和15,600道尔顿的两个组分.Hg⁺⁺、Cu⁺⁺仅部分抑制酶活力,可被二异丙基氟磷酸(DFP)完全抑制.75℃以上加热处理可使酶失活,并大大降低病毒包含体的解离.推测此酶是影响PbGV对寄主感染率的因子之一.     

包涵体-犬传染性肝炎病毒形态发生学的重要特征

用免疫金电镜技术和电镜原位杂交技术观察了犬传染性肝炎病毒感染的犬肾传代细胞中的病毒包涵体,发现这些包涵体具有以下三种基本形态1.松散均质包涵体;2.副结晶色包涵体;3.致密颗粒包涵体.其中前二种包涵体能被免疫金标记,它们是尚未成病毒粒子的病毒蛋白或是病毒装配后乘余的病毒蛋白,后一种包涵体能被病毒DNA探针标记,是病毒核酸合成过剩而堆积起来形成的产物.此外,本文还描述和讨论了包涵体与细胞及病毒发育成熟的关系.     

棉铃虫核型多角体病毒在生态环境中的滞留及作用

棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂可湿性粉剂防治第三代棉铃虫,防治效果为８６．２％。使用酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）检测棉铃虫核型多角体病毒在土壤中的滞留,结果表明：施用病毒杀虫剂１、３、５、７天和两个月后都可检测到该病毒的存在。１９９３年９月上旬从河南封丘棉田采集的露水,ＰＨ为７．９８,病毒多角体在露水中保存３天,其生物活性无明显下降。     

犬瘟热减毒疫苗对小熊猫安全性与免疫原性研究

犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)是副粘病毒科麻疹病毒属成员,与麻疹病毒和牛瘟病毒亲缘关系很近,其基因组为不分节、非重叠的负链RNA,长15 960bp,由6个基因组成,编码N、P、M、F、H、L蛋白.此外,还包括由P基因编码的V和C蛋白[1].由CDV感染引起的犬瘟热,是一种急性、高度接触性传染病,主要引起犬科、鼬科和浣熊科动物的犬瘟热(CD),但是伴随生态环境的变化和犬瘟热病毒对动物流行病因素的适应,它的自然感染宿主范围在不断扩大,危害也越来越大.大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特产的世界级珍稀濒危动物,由于大熊猫具有极高的科研和观赏价值,成了世界人民保护自然资源的象征.近年来有大熊猫发生CD的报道[2],研究大熊猫CD的预防是必要的.小熊猫作为浣熊科的动物,对CDV非常敏感[3].本研究通过犬瘟热减毒疫苗对小熊猫安全性与免疫原性研究,探讨小熊猫作为评价犬瘟热弱毒疫苗对大熊猫的安全性与免疫原性动物模型的可能性.     

包含体——流行性出血热病毒形态学的重要特征

用普通电镜和免疫酶电镜方法观察了流行性出血热病毒A9株和R22株感染的VeroE-6细胞中的病毒包含体,发现这些包含体具有以下三种基本形态:1.丝状或丝状颗粒包含体,2.松散颗粒包含体,3.致密包含体。在免疫酶法中,包含体均呈特异性酶染色阳性反应。描述和讨论了包含体与细胞及病毒发育成熟的关系。     

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒囊膜内核衣壳排列图式的电镜观察

核型多角体病毒有单核衣壳包埋型和多核衣壳包埋型之分,单核衣壳包埋型是在一个病毒囊膜内只包含一个核衣壳,而多核衣壳包埋型的特点是在一个病毒囊膜内包含有２个以上的核衣壳,由于多个核衣壳成束地被包装在同一个病毒囊膜内,又称病毒束［１,２］。Ｈｕｎｔｅｒ等表明在干果斑螟核型多角体病毒中,病毒囊膜内包含２～２３个核衣壳［３］。Ｆｒａｓｅｒ将苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒接种于秋粘虫细胞系,超薄切片电镜观察,病毒囊膜内包含的核衣壳数变动于２～１７粒,但未研究其核衣壳在病毒囊膜内的排列结构［４］。本研究用苜蓿丫纹…