牛泡沫病毒长末端重复序列在大肠杆菌中的启动子功能

泡沫病毒具有复杂的基因组结构,包含典型反转录病毒共有的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)启动子,负责起始结构基因gag、pol、env的表达,并在env基因内部存在独有的内部启动子(internal promoter,IP)[13],用以起始下游反式作用因子Tas(在BFV中称Borf-1)的表达.有报道劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus,RSV)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)LTR可在E.coli中起始基因表达[4,7].泡沫病毒至今未见报道.     

两种真核启动子体内外转录活性比较研究

启动子作为基因工程表达载体的核心组成部分,在很大程度上决定了目的基因的转录活性。为筛选出一个转录活性较高的真核启动子,以目的蛋白与增强型绿色荧光蛋白融合表达的形式,在体内外检测CMV和CAG两种真核启动子的转录活性。首先,通过常规分子生物学技术将神经钙黏着蛋白(N-cad)克隆到p CAG-MCS-EGFP质粒中(携带CAG启动子),菌落PCR、双酶切及测序验证;与p EGFP-N-cad质粒(携带CMV启动子)一起通过磷酸钙法分别转染HEK293T细胞,比较两种质粒在体外细胞水平转染目的基因效率;随后,通过已建立的鸡胚脊髓活体电转方法比较两种质粒在活体鸡胚脊髓内转录目的基因效率,冷冻切片后进行荧光强度观察;而体内外实验均应用常规Western blot和RT-PCR技术验证目的基因N-cad在蛋白及基因水平上的表达。荧光显微镜观察结果表明,CMV启动子仅能在体外细胞水平上行使其转录活性,而CAG启动子可在体内体外高效行使其转录活性,进一步的Western blot和RT-PCR结果与荧光观察结果一致。该研究结果可为体内研究目的基因功能时的载体构建提供借鉴。     

CMV与T7启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较

构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和T7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV。将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-)。用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能。将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR T7/5细胞(稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救;但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用。为了进一步了解CMV与T7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或T7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMV-miniSeV-Gluc(-)和pT7-miniSeV-Gluc(-)。将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR T7/5细胞,结果pT7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显。本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了T7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用。本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础。     

白血病细胞中不同启动子驱动外源基因表达能力差异分析

为了分析不同启动子在白血病细胞中驱动外源基因表达能力的差异,文章选择了4种含不同启动子EF1α、PGK、Ubiquitin和CMV驱动的GFP报告基因的慢病毒载体,用以感染4种不同的白血病细胞株——NB4、HL60、Kasumi和THP1,利用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR的方法检测其GFP表达效率,发现EF1α启动子驱动GFP表达的能力最强,CMV最弱,PGK和Ubiquitin则介于两者之间。该结果提示在白血病细胞中研究基因功能时,应根据不同的研究需求选择最为合适的启动子。     

小鼠白蛋白启动子的组织特异性功能研究

以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,通过对比小鼠白蛋白启动子在不同来源细胞系中启动HGFP基因的转录活性,对小鼠白蛋白启动子的组织特异性进行了研究。结果发现,小鼠白蛋白启动子在小鼠肝癌细胞系Hepa 1—6和人肝癌细胞系：HepG2均有很强的转录起始功能,荧光显微镜下可以观察到IGFP表达。Hepa 1—6细胞在转染早期的48h内,CMV的启动子和增强子序列是小鼠白蛋白启动子转录活性的4倍。G418加压筛选2周后,CMV的启动子的转录活性下降到只有小鼠白蛋白启动子活性的1／2。转染人肝癌细胞系HepG2 2周后,荧光显微镜下可以观察到GFP表达。其他的细胞如中华仓鼠卵巢细胞系CHO和人肺癌细胞系PLA 801中转染的小鼠白蛋白启动子不能启动GFP的表达,而对照CMV启动子控制下的GFP基因可在CHO和PLA 801中表达。以上结果说明,小鼠白蛋白启动子仅在肝脏来源的细胞中可以起始下游基因的转录,在其他组织来源的细胞中不能起始转录,这表明小鼠白蛋白启动子具有肝脏组织特异的转录活性,但没有种属特异性。     

cmv-3′LTR嵌合启动子对逆转录病毒载体MFG滴度及外源基因表达的影响

为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默,进一步提高逆转录病毒载体MFG介导的外源基因的表达水平,同时探讨逆转录病毒3′端长末端重复序列(long terminalrepeat,LTR)内U3区对病毒基因表达的影响,将逆转录病毒载体3′端LTR内的U3区用cmv核心增强子、启动子序列替代,同时去除了3个与逆转录病毒载体启动子甲基化有关的序列NCR、DR,并以egfp为报告基因,构建了MFG egfp和MFG egfp cmv表达载体。结果显示:利用cmv启动子替代MFG载体3′端LTR的U3启动子序列,会显著降低MFG载体的病毒滴度及其介导的外源报告基因的表达。提示利用cmv启动子替代病毒载体的3′端LTR内的U3区,并不是提高MoMLV(moloneymurineleukemivirus)逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略。结果也同时提示:在MoMLV逆转录病毒3′端LTR的U3区,可能存在与病毒RNA加工、成熟及稳定性有关的信号序列。     

cmv-3’LTR嵌合启动子对逆转录病毒载体MFG滴度及外源基因表达的影响

为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默,进一步提高逆转录病毒载体MFG介导的外源基因的表达水平,同时探讨逆转录病毒3’端长末端重复序列(long-terminal repeat,LTR)内U3区对病毒基因表达的影响,将逆转录病毒载体3’端LTR内的U3区用cmv核心增强子、启动子序列替代,同时去除了3个与逆转录病毒载体启动子甲基化有关的序列NCR、DR,并以egfp为报告基因,构建了MFG-egfp和MFG-egfp-cmv表达载体。结果显示：利用cmv启动子替代MFG载体3’端LTR的U3启动子序列,会显著降低MFG载体的病毒滴度及其介导的外源报告基因的表达。提示利用cmv启动子替代病毒载体的3’端LTR内的U3区,并不是提高MoMLV(moloney murineleukemi virus)逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略。结果也同时提示：在MoMLV逆转录病毒3’端LTR限的U3区,可能存在与病毒RNA加工、成熟及稳定性有关的信号序列。     

CMV与SP双启动子增强外源基因在小鼠骨骼肌中的表达效率

构建分别含有CMV、肌肉特异启动子SP及双启动子CMV-SP的真核报告基因EGFP表达载体（pCMV-EGFP、pSP-EGFP及pCMV-SP-EGFP）和生长激素释放因子（GRF）表达载体（pCMV-GRF、pSP-GRF和pCMV-SP-GRF）.将3种EGFP表达质粒分别注射至小鼠骨骼肌.注射后1周、2周、3周以及4周时,分别提取肌肉组织RNA,应用半定量RT-PCR检测报告基因（EGFP）的表达量,发现pCMV-SP-EGFP组EGFP表达量显著高于pCMV-EGFP组和pSP-EGFP组（P<0.01）;经荧光检测得到了较强的荧光信号.将3种GRF表达质粒分别注射至小鼠骨骼肌,在注射后每10 d记录小鼠累积增重,采血并用RIA法测定血清胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）浓度,结果pCMVSP-GRF组累积增重、IGF-I浓度分别高于生理盐水组、pCMV-GRF组和pSP-GRF组（P<0.05）.结果表明：CMV与SP两种启动子组合,在小鼠骨骼肌内使外源基因表达效率提高.本研究为提高外源基因在肌肉组织的表达提供了新的途径.     

双效表达载体的构建及其U6启动子的功能效率鉴定

利用pBudcE4.1双表达载体构建shRNA与蛋白共表达载体,为双效疫苗的研制提供新的研究思路.以含U6启动子的载体为模板,PCR扩增得到U6启动子,用其置换载体pBudcE4.1内的CMV启动子的核心部分构建shRNA与蛋白共表达载体.用干扰绿色荧光蛋白表达的方法鉴定重组载体中的U6启动子能否启动shRNA的表达.经PCR扩增、双酶切鉴定及DNA测序证明成功构建了载体pBudcE4.1-U6.用干扰载体pBudcE4.1-U6-eGFPshRNA与含eGFP的载体共转染293T细胞后,荧光显微镜观察显示eGFP的表达量下降;流式细胞仪检测细胞的转染效率降低.研究结果证明U6启动子正常发挥作用. 成功构建RNAi与蛋白共表达载体,为利用该载体研制动物双效疫苗奠定了基础.     

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7RNA聚合酶 启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞。通过转染真核细胞实验表明 ,采用真核启动子CMV调控T7RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCVIRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因 ,且能适应不同的真核细胞环境 ,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

Photoregulation of seed germination of wild-type and of an aurea-mutant of tomato

Seed germination of an aurea mutant of tomato ( Lycopersicon esculentum Mill.) is promoted by continuous irradiation with red, far-red or long-wavelength far-red (758 nm) light as well as by cyclic irradiations (5 min red or 5 min far-red/25 min darkness). Far-red light applied immediately after each red does not change the germination behaviour. Seed germination of the isogenic wild-type, cv. UC-105, is promoted by continuous and cyclic red light while it is inhibited by continuous and cyclic far-red light and by continious 758 nm irradiation. Far-red irradiation reverses almost completely the promoting effect of red light. The promoting effect (in the aurea mutant) and the inhibitory effect (in the wild-type) of continuous far-red light do not show photon fluence rate dependency above 20 nmol m⁻² s⁻¹. It is concluded that phytochrome controls tomato seed germination throgh low energy responses in both the wild type and the au mutant. The promoting effect of continuous and cyclic far-red light in the au mutant can be attributed to a greater sensitivity to P_fr.