含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体的制备与表达分析

目的:制备含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体,为慢病毒载体的进一步广泛应用奠定基础。方法:克隆构建含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的转基因载体pCS-gluc-2A-eGFP,酶切与序列分析鉴定其正确后,与包装质粒pCMVHR’Δ8.2、包膜质粒pVSV-G共转染293FT细胞,获得含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体;重组慢病毒载体感染A549、Huh7细胞后,用荧光显微镜直接观察报告基因GFP的表达,或取细胞上清实时检测分泌型萤光素酶的表达。结果:制备了含双报告基因的重组慢病毒载体,感染细胞后可以活体观察绿色荧光蛋白的表达,也可以快速灵敏地检测到分泌型萤光素酶的表达。结论:所获含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体感染效率高,表达易于活体实时检测,灵敏度高。本研究为慢病毒载体的广泛应用奠定了基础。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

CHD5基因RNAi慢病毒载体的构建及其对结直肠癌细胞生物学功能的影响

目的:研究人类肿瘤相关基因CHD5基因miR-shRNA慢病毒对结直肠癌Lovo细胞的影响。方法:利用软件设计对CHD5基因干扰有效的序列,合成靶序列,退火形成双链DNA,酶切后与载体相连接。将重组慢病毒载体pPRIME-TET-GFP-CHD5与慢病毒包装质粒pCMV-VSV-G,pRSV-Rev,pMDLg-pRRE共转染293FT细胞,将包装重组慢病毒感染人类结直肠癌Lovo细胞。通过荧光定量PCR和Western blot验证CHD5基因在细胞中的表达情况,应用MTT检测CHD5低表达对Lovo细胞增殖的影响。结果:成功构建pPRIME-TET-GFP-CHD5重组质粒,经酶切及序列测定正确,包装的病毒滴度为3.1×106TU/ml。用制备的病毒上清感染Lovo细胞后,荧光定量PCR和Western blot分析结果显示该慢病毒可分别在转录和蛋白质水平上抑制Lovo细胞CHD5基因的表达,并使得Lovo细胞增殖失控。结论:成功构建CHD5慢病毒表达载体,表达的慢病毒可有效的感染Lovo细胞,提高Lovo细胞的增殖能力。     

Ratiometric-pericam-mt慢病毒的构建及其线粒体钙检测功能的验证

目的:基于由环状异构黄色荧光蛋白(Circularly Permuted EYFP)改造的具有线粒体定位功能的Ratiometric-pericam-mt(rp-mt)荧光蛋白构建携带有rp-mt基因的慢病毒载体,验证其在线粒体钙检测中的功能,为进一步研究线粒体钙稳态在细胞生命活动中发挥的作用提供参考依据。方法:采用慢病毒载体EF-1αF-puro和rp-mt质粒构建携带有rp-mt基因的重组慢病毒载体,经脂质体法在293T细胞中与包装质粒共转染,收集构建好的重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt并体外感染人肝癌细胞SNU-739,验证重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt的活性功能。结果:以慢病毒载体EF-1αF-puro为骨架质粒,成功构建了携带有rp-mt基因的重组慢病毒载体(EF-1αF-puro-rp-mt),收集获得的重组慢病毒滴度为4×10~6TU/m L。将携带有rp-mt基因的慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt感染SNU-739细胞48小时后,在荧光显微镜下观察到有超过85%的细胞发出绿色荧光,定位于细胞线粒体内,且对SNU-739细胞进行Ru360和CGP37157处理后,细胞荧光强度随线粒体内钙水平改变而增强或减弱。结论:采用脂质体包装法成功构建了携带有rp-mt基因的重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt,细胞经该慢病毒转染后可稳定表达具有线粒体定位功能的荧光蛋白rp-mt,准确地检测细胞线粒体钙离子水平。     

重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析。MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白（GFP）表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度。结果成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E＋8 TU/mL。结论本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础。     

慢病毒介导的稳定表达LBH的前列腺癌细胞株的建立

目的:构建稳定表达LBH基因的人前列腺癌细胞株PC-3M-LBH,探讨LBH基因对PC-3M细胞增殖能力的影响。方法:构建表达LBH基因的重组慢病毒载体并制备出相应的慢病毒,感染低表达LBH基因的人前列腺癌PC-3M细胞后,经嘌呤霉素筛选获得细胞克隆;实时荧光定量PCR和蛋白印迹法(Western-Blot)分别检测细胞株中LBH的mRNA、蛋白表达水平;采用CCK-8法检测表达LBH基因后细胞增殖能力的改变。结果:成功构建了重组慢病毒表达质粒p Lenti-LBH并包装出了慢病毒,感染前列腺癌细胞后经嘌呤霉素筛选得到PC-3M-LBH细胞株;PC-3M-LBH细胞株中LBH基因的mRNA和蛋白表达显著上调;相对母细胞和NC对照组,PC-3M-LBH细胞在接种后第4天即出现明显的生长抑制,到第6天其生长抑制率达到19.7%。结论:构建的细胞株能稳定表达LBH基因,该基因的表达能显著抑制前列腺癌PC-3M细胞的体外增殖。     

miR-125b慢病毒表达载体的构建及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖和迁移的影响

构建并鉴定miR-125b慢病毒过表达载体,研究miR-125b对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响及其可能机制。将PcR扩增的rniR-125b前体序列与经过酶切后的GP—SupersilencingVector进行连接,产生miR-125b重组慢病毒表达载体。将重组慢病毒载体质粒、pGag／Pol、pRev和pVSV-G共转染293T细胞,包装产生慢病毒。使用收获的病毒颗粒感染卵巢癌SKOV3细胞,嘌呤霉素筛选稳定感染细胞株;实时荧光定量PCR（Real．timeqPCR）检测miR-125b在SKV03细胞中的表达;Westernblot检测其潜在靶基因HER-2的表达：MTT实验和Transwell侵袭实验分别观察miR-125b过表达后SKOV3细胞增殖和迁移能力的改变。该研究成功构建miR-125b陧病毒过表达载体,感染卵巢癌SKOV3细胞后,能够过表达miR-125b,并抑制SKOV3细胞的增殖及迁移,降低潜在靶基因HER-2的表达。该研究证叽miR-125b能够抑制SKOV3细胞的增殖及迁移,并可能通过降低潜在靶基因HER-2的表达而实现。     

慢病毒载体介导RAB27A基因过表达对人HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的：构建RAB27A基因慢病毒表达载体,并研究RAB27A 对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法：以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板,PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长,酶切后插入穿梭载体pENTR/U6,再应用Gateway技术,基因重组到表达载体pHAGE-EF1α-puro-DEST上,构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后,将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度;Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A 蛋白表达水平;CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果：经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确;浓缩后病毒滴度较高;重组慢病毒感染HepG2细胞后,细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调,HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制（P<0.01）,S期细胞分布比例明显降低（P<0.01）。结论： RAB27A 基因重组慢病毒表达载体构建成功,外源过表达RAB27A 基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色。     

转基因鸡生物反应器载体的构建及其表达特性分析

以增强型绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶为报告基因,构建了鸡卵清蛋白启动子表达载体和慢病毒载体,以巨细胞病毒 (Cytomegalovirus,CMV)启动子表达载体为对照,转染或感染鸡原代输卵管上皮细胞、鸡胚成纤维细胞、鼠3T3-L1前脂肪细胞和牛乳腺上皮细胞,通过荧光和酶活性检测,旨在筛选出用于实现转基因鸡生物反应器的高效特异性表达载体。结果发现,鸡卵清蛋白启动子表达载体转染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,没有表现出明显的细胞特异性,且荧光素酶检测结果表明其在各细胞组中表达活性都低于CMV启动子表达载体100倍以上;慢病毒载体感染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,在鸡输卵管上皮细胞组感染单个细胞的病毒颗粒 (Multiplicity of infection,MOI) 为20时绿色荧光蛋白表达量就可以达到CMV启动子表达载体的水平。上述结果表明,基于卵清蛋白基因调控序列构建的表达载体无法实现外源基因的高效、特异性表达,而慢病毒载体在表达活性和广泛性上可以用于进行鸡输卵管生物反应器的研究。     

Interplay between modified vaccinia virus Ankara and dendritic cells: phenotypic and functional maturation of bystander dendritic cells

Modified vaccinia virus Ankara (MVA) is an attenuated poxvirus strain, currently under evaluation as a vaccine vector in various clinical settings. It has been reported that human dendritic cells (DCs) mature after infection with MVA, but reports on the functionality of DCs have so far been controversial. In this work, we studied the phenotype and functionality of MVA-infected DCs. As previously reported, we found that human monocyte-derived DCs upregulated CD86 and HLA-DR in response to MVA infection. Moreover, infected DCs produced a broad array of chemokines and cytokines and were able to activate and induce gamma interferon (IFN-γ) production both in CD4(+) and in CD8(+) allogeneic T cells and in specific autologous peripheral blood lymphocytes (PBLs). Analysis of DC maturation following infection with a recombinant green fluorescent protein (GFP)-expressing MVA revealed that upregulation of CD86 expression was mainly observed in GFP(neg) (bystander) cells. While GFP(pos) (infected) DCs produced tumor necrosis factor alpha (TNF-α), they were unable to produce CXCL10 and were less efficient at inducing IFN-γ production in CEF-specific autologous PBLs. Maturation of bystander DCs could be achieved by incubation with supernatant from infected cultures or with apoptotic infected cells. Type I IFNs were partially responsible for the induction of CXCL10 on bystander DCs. Our findings demonstrate for the first time that, in MVA-infected DC cultures, the leading role with respect to functionality and maturation characteristics is achieved by the bystander DCs.     

Rapid generation of dendritic cell specific transgenic mice by lentiviral vectors

Dendritic cell (DC) specific transgenic mice are a most important model for investigating dendritic cell functions in vivo. Recently, lentivirus mediated gene transfer has become a powerful and convenient method for generation of transgenic mice. We cloned a 1.2 kb CD11c promoter and constructed a lentiviral vector, which efficiently drove DC-specific expression in vitro. After microinjection of purified virus into the perivitelline space of single-cell embryo, more than 80% newborn mice were transgenic and 7 F0 founders were rapidly generated in 2 months. GFP was strictly expressed in CD11c+ cells in spleens, thymus and lymph nodes of the transgenic mice. Importantly, the physiological characteristics and functions of DCs in the transgenic mice were not altered by the specific expression. These results indicate that this vector could be used to rapidly prepare DC-specific transgenic mice. Thus, this lentiviral vector system may provide a convenient and useful tool to study the properties of DCs in vivo.     

Expression of double foreign protein types following recombinant baculovirus infection of stably transfected Drosophila S2 cells

We sought to develop a platform for simultaneous, regulatable expression of double foreign protein types in cell culture. Drosophila melanogaster Schneider line 2 (S2) insect cells that stably express human erythropoietin (hEPO) were infected with a recombinant baculovirus containing the green fluorescent protein (GFP) gene. Since baculovirus cannot replicate in nonpermissive S2 cells, baculovirus infection did not affect cell growth or viability. Expression of each foreign protein was under the control of the inducible metallothionein (MT) promoter. Addition of copper sulfate to infected, stably transfected cells resulted in simultaneous expression of both GFP and hEPO. Induced hEPO expression profile and levels were similar in both control and infected cells, indicating that baculovirus infection also did not affect expression of stably introduced foreign gene. GFP protein levels were regulated by the infection dose of recombinant baculovirus, while hEPO expression remained constant. hEPO levels were much higher (30-fold) than GFP, indicating plasmid-based introduced gene copies have higher expression than baculovirus-based introduced genes. These data suggest the baculovirus/stable S2 cell system can be used to produce a major target protein by plasmid-based stable transfection, and assistant proteins by recombinant baculovirus infection. Such a system appears to be very attractive as a multiple protein expression platform for engineering metabolic pathways in cell culture.     

慢病毒载体系统介导hUC—MSC绿色荧光蛋白和荧光素酶共表达技术体系的建立

目的建立慢病毒载体系统介导的人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶共表达技术体系。方法 GFP和荧光素酶共表达慢病毒载体与相应包装质粒psPAX2和pMD2.G经聚乙烯亚胺介导共转染HEK293T细胞以包装病毒;病毒感染P4代hUC-MSC 12 h后,再行嘌呤霉素筛选24 h,普通光学显微镜观察细胞形态,荧光显微镜下观察GFP的表达情况,IVIS Kinetic成像系统拍照以观察和记录慢病毒感染后hUC-MSC荧光素酶的表达情况;MTS法行细胞生长曲线作图,同时,普通和实时定量RTPCR法检测细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和p21WAF1/CIP1的表达。采用方差分析和t检验进行统计学分析。结果慢病毒感染并不会造成体外培养hUC-MSC形态的明显改变,而荧光显微镜和IVIS Kinetic成像系统的观察结果则分别证实,GFP和荧光素酶经慢病毒载体系统的介导可在hUC-MSC中成功地共表达。此外,细胞生长曲线作图结果表明,对照和GFP及荧光素酶共表达慢病毒感染后hUC-MSC的生长增殖速率相仿（P〉0.01）;实时定量RT-PCR法检测结果则显示,与对照慢病毒感染相比,GFP和荧光素酶共表达慢病毒感染后其细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E1和p21WAF1/CIP1mRNA表达水平分别是对照组的1.11倍（P=0.130）、0.54倍（P=0.000）和0.78倍（P=0.005）,表明外源GFP和荧光素酶共表达对体外培养的hUC-MSC生长增殖等表型无显著影响。结论慢病毒载体系统可有效介导外源基因在hUC-MSC中的表达;同时,GFP和荧光素酶在hUC-MSC中的共表达也将极大地方便其体内转归的示踪。