pGEX-4T-1/Tα1-TP5原核表达载体的构建及表达

旨在构建胸腺融合肽Tα1-TP5原核表达载体,并在大肠杆菌中表达.化学合成Tα1-TP5基因,与原核表达载体pGEX-4T-1融合并转化至E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统对工程茵表达的蛋白进行分析鉴定.表达的GST融合蛋白经GST琼脂糖...     

大肠杆菌ybfE基因的三种原核质粒表达水平的对比及蛋白纯化北大核心

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因ybf E的pET16b、pET32a和p GEX-4T-1三种原核表达系统,通过对比表达水平筛选出最优表达体系,并纯化表达的可溶性Ybf E融合蛋白。[方法]使用pET16b、pET32a和p GEX-4T-1表达质粒构建pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达载体,分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白,对三种表达系统的表达水平进行对比,并对pET16b-ybf E和pGEX-4T-1-ybf E表达体系的裂菌上清中的可溶性Ybf E融合蛋白液分别使用镍柱和GST蛋白纯化柱纯化。[结果]构建了pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达体系,并使用IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白。ybf E在p GEX-4T-1载体内的表达水平最高,接下来依次为pET16b和pET32a。pET16b-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E表达的可溶性Ybf E融合蛋白纯化后浓度分别为86μg/m L和724μg/m L。[结论]成功构建了ybf E基因的三种原核表达系统,筛选出最佳表达体系,可溶性Ybf E融合蛋白得到纯化。     

P100蛋白及其片段重组质粒构建与表达

目的分别将人类p100基因,p100的SN基因片段和TD片段定向连入pERFP-CI质粒,使它们可与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,从而为进一步研究P100蛋白及其片段的定位、功能及与其它蛋白的相互关系奠定实验基础。方法PCR分别扩增出P100蛋白全长,SN片段和TD片段基因的序列,定向克隆至真核表达载体pERFP-CI,构建相应的3种重组质粒。将构建成功的质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下可观察红色荧光融合蛋白表达。结果①PCR法获得P100基因序列,长度为2659bp,SN基因片段1918bp,TD基因片段741bp;②将重组质粒直接进行双酶切鉴定可见P100片段,将经过蓝白斑筛选后的重组子经双酶切再与pERFP-CI载体连接并酶切得到SN片段和TD片段;③转染重组质粒后可观察到红色荧光蛋白的表达。结论3种外源片段成功载人pERFP-CI质粒;P100全长、SN片段、TD片段均可与红色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。     

人Tudor-SN基因启动子荧光素酶报告基因表达质粒的构建及活性检测

目的 将人类Tudor-SN基因的启动子序列片段定向连入pGL3-Basic质粒载体,并进行鉴定和启动子活性检测.方法 以HeLa细胞全基因组DNA为模板,PCR法扩增出目的基因,利用XhoⅠ和HindⅢ双酶切法将目的片段连接到pGL3-Basic载体上.再将构建成功的pGL3-Basic-Tudor-SN-promoter重组质粒和内参质粒β-gal瞬时共转染入宫颈癌HeLa细胞,培养48 h后检测萤火虫荧光素酶活性.结果 双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,转染重组质粒后可检测到萤火虫荧光素酶活性.结论 成功构建了人类Tudor-SN基因启动子重组质粒,为Tudor-SN蛋白基因调控机制的研究奠定基础.     

Anti-HIF-1α-pEGFP重组质粒的构建及表达

目的构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,转染人宫颈癌Hela细胞,用以探讨HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用。方法应用基因重组技术构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,通过脂质体介导将其转染入Hela细胞,倒置荧光显微镜观察转染效果,Western blot检测HIF-1α蛋白的表达。结果酶切鉴定结果显示含EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建成功,并能在Hela细胞中封闭HIF-1α蛋白的表达。结果 EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建及转染成功,封闭Hela细胞中HIF-1α蛋白的表达,为进一步研究HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用提供试验基础。     

Tudor-SN蛋白一级结构间断的SN5结构域质粒的拼接构建

目的 实现Tudor-SN蛋白TSN结构域内间断的SN5基因片段（SN5α、SN5β）的拼接以及与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中的融合表达.方法 利用Geno 3D对拼接的SN5进行结构预测.以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR分别扩增出SN5α和SN5β的基因,双酶切并纯化后,先将SN5β引入pEGFP-C2,完成重组质粒pEGFP-C2-SN5β,再将SN5α引入pEGFP-C2-SN5β,完成重组质粒pEGFP-C2-SN5.将pEGFP-C2-SN5β/ SN5脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达.结果 ① 拼接的SN5结构预测显示与TSN完整结构中的SN5高度重合;②对重组质粒进行双酶切鉴定可见SN5α、SN5β、SN5的cDNA片段;③ 转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达;④ Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白.结论 pEGFP-C2-SN5/SN5β重组质粒构建成功,SN5α和SN5β在pEGFP-C2中实现了顺序拼接;目的片段可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达,融合蛋白可与抗GFP抗体结合用于蛋白检测.     

环鸟苷二磷酸代谢相关基因PXO03877的原核表达

分别利用表达载体pET-32a(+)和pGEX-4T-1,对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzzae v.oryzae,简称Xoo)中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PXO_03877进行了原核表达,并进行可溶性检测.结果显示,用pET-32a(+)栽体构建的表达质粒栽体经诱导后,重组蛋白大多位于沉淀而非上清中,经诱导条件优化后,蛋白仍以包涵体形式存在;而利用pGEX-4T-1载体表达的含有GST标签的重组蛋白为可溶性蛋白,可用于下一步纯化后进行功能分析.     

重组pEGFP—C2-p100-TSN点突变质粒构建及表达

目的将6个不同的p100-TSN．Mutants基因片段分别定向连入PEGFP—C2质粒中,使P100-TSN突变蛋白能够与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达,从而为进一步研究p100蛋白TSN结构域的功能奠定实验基础。方法利用EcoR I和Xho I双酶切方法从6个pcDNA3．1（＋）-p100-TSN．Mutants重组质粒中分别获得p100-TSN．Mutants的cDNA片段,将其连人pEGFP—C2质粒载体中,再将成功构建的6个pEGFP—C2-p100-TSN．Mutants质粒分别转染COS7细胞中,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果①将重组质粒进行双酶切鉴定可见p100-TSN．Mutants的cDNA片段;②转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论①6个pEGFP—C2-p100-TSN．Mutants重组质粒构建成功;②p100-TSN突变蛋白可与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达。     

sTACI-Fc-Myc重组质粒的构建、原核表达及活性鉴定

目的:构建s TACI-Fc-Myc重组质粒,并进行原核表达和纯化具有生物活性的融合蛋白。方法:通过PCR法获得s TACI-Fc-Myc重组片段,然后把融合基因片段与原核载体p ET28a连接在一起,并构建p ET28a-s TACI-Fc-Myc重组子,并转入BL21(DE3)中进行表达,用蛋白A凝胶亲和层析柱进行纯化及酶联免疫吸附剂(ELISA)法测定其生物学活性。结果:获得了s TACI-Fc-Myc重组质粒,且该质粒可以在BL21(DE3)中表达,亲和层析柱纯化后纯度可达到95%以上,与BAFF的结合活性具有剂量依赖性,浓度达到5 ng/μL时,两者的吸附达到饱和。结论:成功构建了s TACI-Fc-Myc原核表达载体,并使有生物学活性的融合蛋白在BL21(DE3)上获得了稳定表达,为进一步研究并筛选高活性BAFF拮抗肽奠定了基础。     

通过同源重组构建酿酒酵母新型表达质粒

利用同源重组的方法, 构建了具有高拷贝数和高稳定性的新型酿酒酵母表达质粒. 对酵母附加体型载体pHC11进行一系列改造, 得到质粒pHC11R, 并用适当的酶切线性化; 利用PCR反应得到人IFNα2b表达单元片段, 它的两端和线性化的pHC11R的两端具有50 bp左右的同源区段. 上述两个片段共转化酿酒酵母, 在酵母体内经同源重组后得到表达质粒pHC11R-IFNα2b, 该表达质粒与 pHC11-IFNα2b相比去除了质粒上用于在大肠杆菌中复制和筛选所需的序列, 在宿主菌中的稳定性和拷贝数均有明显提高, 同时外源基因的表达量也获得了一定程度的提高. 在此基础上, 进一步构建了带有不同表达元件的pHR系列载体, 使得外源基因能够通过同源重组在酿酒酵母中快速、方便地克隆和表达.     

Epstein—Barr病毒BCRF1的基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

应用基因重组技术,把编码ＥＢ病毒早期蛋白ＢＣＲＦ１基因重组于真核表达载体ｐＳＧ５中,并使该基因在乳地鼠肾（ＢＨＫ）传代细胞中获得良好表达,表达率为０．５％,血清学实验证实,鼻咽癌,类风湿性关节病人和正常人血清中均不同程度地含有ＩｇＧ／ＢＣＲＦ１抗体,抗体阳性率分别主９２％,８６％和７７％,几何平均滴度（ＧＭＴ）分别是：１：１６．３５,１：１４．７２和１：１０．１５。两组病人和正常人血清中ＩｇＡ／Ｂ     

PDX-1表达质粒的构建及表达

目的:为进一步研究PDX-1基因的功能打下基础.方法:从人的胰腺cDNA中PCR扩增PDX-1基因的阅读框架,构建质粒pAAV-PDX-1.用pAAV-PDX-1转染293T细胞48小时后,用RT-PCR和Western Blot方法检测293T细胞中mRNA和蛋白水平PDX-1的表达.结果:转染了pAAV-PDX-1的293T细胞中有PDX-1的表达,而在转染质粒pAAV-MCS和未转染的293T细胞中均没有检测到PDX-1的表达.结论:构建的pAAV-PDX-1质粒在mRNA和蛋白水平都能表达PDX-1.     

pQE32-FOXP4ORF质粒的构建及其表达的研究

利用已建立的GenBank数据库提供的已知序列,初步克隆了一个新的人类基因,经国际基因命名委员会批准命名为FOXP4(forkheadboxP4).FOXP4的开放阅读框ORF长4186bp,包含有17个外显子,可以编码一个667个氨基酸的多肽链,蛋白质相对分子质量大小为73.4kDa.为了研究FOXP4基因编码产物在细胞内的作用,构建表达型质粒(pQE32)与FOXP4基因的穿梭表达载体pQE32-FOXP4ORF.利用异丙基硫代-βD-半乳糖苷(isopropyl-βD-t-hiogalactoside,IPTG)对蛋白质的表达进行诱导,在适合的温度和浓度下,经过一定的时间,使细胞大量表达外源蛋白.用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测,得出诱导的最佳的浓度和温度,再进行大量诱导,通过电泳分离,将外源蛋白提取出来,从而对基因的功能进行进一步的研究.     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3．1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1—egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45％。瞬时转染pcDNA3．1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

重组胸腺素α1 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的构建与表达

目的构建表达重组胸腺素α1（Tα1）的pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌。方法将人工合成的Tα1序列进行PCR扩增,将扩增的片段和pMAL-C2x质粒载体分别经BamHI和EcoR I双酶切后,用T4 DNA快速连接酶连接构建pMAL-C2x-Tα1融合表达质粒,再经测序正确后,将重组体转化至大肠埃希菌TB1菌中,pMAL-C2x-Tα1/TB1菌在LB液体培养基中培养,经IPTG诱导表达麦芽糖结合蛋白与Tα1的融合蛋白（MBP-Tα1）,采用Westernblot对MBP-Tα1进行鉴定。结果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表达MBP-Tα1,融合蛋白占菌体蛋白的33.6%,分子量约为45×103。结论工程菌的成功构建和表达为重组Tα1的纯化、生物学活性等研究奠定了基础。     

沙眼衣原体真核表达质粒pcDNA4/CT703的构建及其表达

目的：构建含沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）基因CT703的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法：利用RT-PCR扩增CT703基因,然后将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,PCR、双酶切和测序检测重组质粒.将正确的重组质粒瞬时转染HeLa细胞,免疫荧光和Western Blot实验检测重组质粒目的蛋白表达. 结果：经PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,将其转染HeLa细胞后,免疫荧光和Western Blot实验能检测到目的蛋白的表达.结论：成功构建了重组质粒pcDNA4/CT703,并能在HeLa细胞中表达,为进一步研究CT703的功能奠定了基础.     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。     

一种真核细胞分泌型重组融合蛋白rPC的构建、表达与纯化

抑制性免疫检查点PD-1或CTLA-4靶向治疗药物已用于肿瘤的临床治疗,但单一靶点药物会有耐药发生,联合使用同时封闭多个靶点可提高疗效,因此拟构建一个可封闭多个靶点的新型重组蛋白。首先设计并合成了一个由人类PD-1和CTLA-4两个受体的胞外功能域组成并且C端带6×His标签的分泌型重组融合蛋白rPC编码序列,插入真核细胞表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1,稳定转染HEK293细胞,收集细胞培养上清,以亲和方法纯化重组蛋白rPC,通过实时荧光定量PCR检测多个人类肿瘤细胞系中PD-1配体PD-L1、PD-L2和CTLA-4配体CD80、CD86的表达,以选择相对高表达的细胞,利用细胞免疫荧光染色方法检验rPC与肿瘤细胞的结合能力,并用CCK-8法检测rPC是否对肿瘤细胞的生长有影响。结果表明,重组融合蛋白rPC可由稳定转染表达载体的HEK293细胞表达并分泌,纯化后的rPC可以与PD-1和CTLA-4配体表达相对较高的肺癌细胞NCI-H226结合,并且rPC处理对其生长并无直接影响,与预期一致。成功获得的重组融合蛋白rPC可用于进一步的体内外功能研究,也为今后研发新型多靶点肿...     

p LA-PEDV-S1质粒拷贝数与发酵重组乳酸菌S1表达量之间的相关性研究

探究质粒拷贝数以及目标蛋白S1表达量与发酵时间的关系,从而确定放大生产p LA-PEDV-S1/Lactobacillus casei的最佳发酵时间。通过发酵重组干酪乳杆菌,绘制重组干酪乳杆菌的生长曲线,确定其生长的最佳时期。将p LA-PEDV-S1/L. casei分别接种至添加抗生素和不添加抗生素的MRS培养基中传代培养,进行稳定性实验。使用荧光定量PCR方法检测重组干酪乳杆菌中质粒的拷贝数,使用流式细胞术检测乳酸菌表达的目标蛋白。重组菌在7 h达到生长顶点,传至120代时外源质粒并无丢失情况出现。质粒拷贝数在9 h达到峰值29. 34,表达目标蛋白的重组菌在7 h达到峰值97. 98%。结果显示在细菌生长的对数生长期末期,质粒拷贝数最高且S1表达量最多;在平台期随着发酵时间的增加,质粒拷贝数逐渐降低,S1表达量也相应减少。发酵的最佳时间为7～10 h,质粒拷贝数与S1表达量之间存在着正相关性。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。