磁处理水对小鼠血液过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响

将小鼠随机分为饮用磁处理水的实验组及饮用自来水的对照组，每组雌、雄鼠各半，饲养一个月，取血测定其过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力。结果雌、雄实验组CAT活性均显著高于对照组；雄鼠实验组GSH-PX活力明显高于对照组，雌鼠实验组GSH-PX活力与对照组无显著差异。显示饮用一定时间磁处理水的小鼠机体外理自由基能力有所提高。     

人髓过氧化物酶基因cDNA克隆及急性白血病髓过氧化物酶基因的表达

应用PCR技术和DNA重组技术从HL－60细胞中克隆人髓过氧化物酶(MPO)轻链和部分重链基因cDNA片段,经核酸序列分析确证克隆片段全长769bpc将克隆的MP0 cDNA片段作为探钎,对一组白血病细胞系和急性白血病病例样本细胞的mRNA进行N0rthern印迹和点印迹分析,结果显示,MPO基因表达产物与急性白血病的粒细胞源性相关,因而它可作为白血病分型中确定细胞源性的重要标志。     

冬枣过氧化氢酶基因的克隆及表达分析

从冬枣半红期和全红期果实的SSH文库中筛选得到与桃树CAT1基因相似性高达88%的基因片段。根据该基因片段设计特异性引物,通过5′和3′-RACE扩增,拼接得到1 586bp序列,该序列包含了1 479bp的完整开放阅读框,编码492个氨基酸,具有CAT基因家族的保守功能域,命名为ZjCAT,GenBank登录号为JN831452。氨基酸序列分析表明,ZjCAT与桃树、陆地棉等多种植物的过氧化氢酶有很高的相似性,并属于类型Ⅲ过氧化氢酶。实时PCR分析结果显示,ZjCAT基因在冬枣不同组织和果实成熟期差异性表达,其中在冬枣半红期果实中表达量最高。表明ZjCAT基因在冬枣果实成熟衰老过程中可能具有重要的调控作用。     

甘蔗过氧化氢酶基因的电子克隆及生物信息学分析

应用电子克隆技术,获得甘蔗中一个过氧化氢酶基因的cDNA序列全长,命名为S-CAT。该基因全长2160bp,包含一个1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。通过PSORT工具,预测甘蔗S-CAT蛋白存在于过氧化物酶体中。同源比对分析显示,S-CAT基因编码的氨基酸序列与水稻、玉米、高粱、朝鲜碱茅、葡萄等植物中过氧化氢酶基因所编码的氨基酸序列高度同源,同源性分别为97%,97%,95%,91%和92%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

人canstatin基因的克隆

为深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性,针对canstatin cDNA序列设计引物,运用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）从人胚肝组织中钓取canstatin cDNA,将其克隆入pMND18-T载体中,通过酶切鉴定出重组体并测序分析,结果表明,获得684bp人canstatin基因,成功构建人canstatin cDNA 克隆载体pMB18-T/canstatin,为进一步进行canstatin蛋白表达及活性研究奠定了基础。     

烟草烟酰胺酶基因的克隆及序列分析

烟酰胺酶是烟草中烟碱合成途径中的关键酶之一.在植物中,通过烟酰胺酶的催化作用,烟酰胺转化成烟酸,烟酸是合成烟碱的一个重要底物.从烤烟品种南江3号(Nicotiana tobacum cv.Nanjiang-3)均一化全长cDNA文库中克隆获得烟草烟酰胺酶基因cDNA全长序列(命名为T-nic1),GenBank中的登录号为HQ448853,该基因全长为841 bp.利用ORF finder和ProtParam软件分析显示,它包含一个完整的开放读码框,编码一个含有162个氨基酸、等电点为4.94、分子量为18.2 kD的小分子量蛋白.Blast搜索结果及进化分析结果表明,该基因编码的蛋白与毛果芍药、拟南芥中的烟酰胺酶序列具有较高的同源性,其氨基酸序列一致性分别为71%、67%.     

青岛文昌鱼过氧化氢酶基因的克隆及生物信息学分析

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,是生物体内抗氧化酶体系的重要成员,因此本研究旨在克隆文昌鱼CAT基因并对其进行生物信息学分析。本研究以青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)为材料,用RACE技术首次克隆了其CAT全长cDNA的基因序列,命名为AmphiCAT(GenBank登录号:KU058636);该序列总长为2640 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1533 bp,编码510个氨基酸,含有一个长为19个氨基酸序列的潜在活性位点和一个长为9个氨基酸序列的血红素配体信号,总分子量在线预测约为57.85 kD;经生物软件分析确定该蛋白质无信号肽序列,预测该蛋白质为非分泌性蛋白,属于单功能CAT的clade3分支;该基因的分子进化树表明青岛文昌鱼CAT同软体动物的亲缘关系较近。     

盐穗木过氧化氢酶基因的克隆与功能分析

利用同源基因克隆法,从新疆荒漠盐碱地多年生灌木盐穗木(Halostachys caspica)中克隆获得盐穗木过氧化氢酶基因(HcCAT1)。序列分析表明,HcCAT1基因开放阅读框为1 479 bp,编码492个氨基酸,推测编码蛋白质的分子量为56.7 kD,等电点为6.84。基因序列比对发现,HcCAT1与多种植物过氧化氢酶基因具有较高的同源性。半定量RT-PCR结果表明,HcCAT1基因受盐胁迫而上调表达。将构建的重组质粒pET32a-HcCAT1转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导重组蛋白His-HcCAT1的表达;SDS-PAGE和Western印迹检测显示,重组蛋白的分子量大小为77.7 kD,其大小与推测的大小一致;在低温诱导下以可溶性形式表达,且表现出一定的过氧化氢酶活性。盐胁迫实验结果显示,在添加400 mmol/L NaCl、400 mmol/L KCl以及300 mmol/L甘露醇的LB培养基中,重组质粒转化菌的生长情况和生长速率明显优于对照,表明HcCAT1可明显提高大肠杆菌的耐盐性。该研究结果将有助于从抗氧化角度认识盐生植物盐穗木的耐盐分子机理。     

过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆表达及发酵优化

利用PCR扩增技术得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)过氧化氢酶基因katA,将该基因与表达载体pET-20b(+)连接构建重组质粒,经测序验证后,在大肠杆菌JM109中进行表达得到重组大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-katA).SDS-PAGE电泳结果显示出...     

草鱼过氧化氢酶全长cDNA的克隆、序列同源分析与组织表达

过氧化氢酶(catalase,CAT)是生物体内抗氧化防御系统的关键酶之一,在清除过氧化氢而避免机体产生氧化应激的过程中起重要作用.本研究从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝胰脏中克隆了CAT完整编码序列(complete coding sequence,CDS).该CAT序列(GenBank登陆号:FJ560431)全长2 263 bp,包括完全开放阅读框(ORF) 1 575 bp、5'非编码区(UTR) 118 bp和3' UTR 570 bp.其ORF编码525个氨基酸残基,理论分子量为59.59 kD,等电点为7.02.在草鱼CAT cDNA的终止密码子附近,其3' UTR具有长且完整的AC重复序列,与斑马鱼、鲢鱼及啮齿类动物CAT的3' UTR AC重复序列相似.序列比较表明,草鱼CAT的核苷酸及推测氨基酸序列与其它多种物种的一致性均较高,其一致性分别为93.4%~43.0%和98.1%~63.3%.同时,草鱼CAT cDNA的推测氨基酸序列具有与其它动物高度保守的特征性基序,包括亚铁血红素结合信号序列"RLFSYPDTH"、酶活性中心序列"FDRERIPERVVHAKGA"及3个催化位点残基His74、Asn147和Tyr357.此外,草鱼CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与NADPH 结合位点.根据草鱼CAT基因的上述特征,推测其属于CAT基因家族中的单功能或典型CAT基因亚群.采用实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测草鱼CAT的组织表达特征.结果显示,草鱼CAT mRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝中表达水平量较高,在红肌、白肌和脂肪中表达量较低.本研究结果将有助于进一步探讨鱼类CAT基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础.     

人ob基因克隆及其亚细胞定位的研究

目的:旨在克隆人肥胖(obese,ob)基因的全长cDNA序列,与EGFP重组构建融合蛋白表达载体,并分析其亚细胞水平的定位.方法:提取人脂肪细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出人ob基因cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-CI,重组质粒转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜分析EGFP-ob融合蛋白的亚细胞定位.结果:克隆的ob基因cDNA为501bp,共编码167个氨基酸,与GenBank公布的人ob基因序列一致,荧光显微镜分析表明,重组的EGFP-ob融合蛋白主要分布于NIT-3T3的细胞质中.结论:成功克隆了人OB基因的cDNA序列,构建人OB基因的真核表达载体pEGFP-CI-ob,融合蛋白EGFP-ob定位于NIH-3T3细胞质中.     

人ZP3基因的RT-PCR cDNA克隆

目的：研究人ZP3基因的结构及构建人ZP3基因原核表达系统。方法：从人卵巢组织中分离出mRNA并以此作为模版,通过RT—PCR扩增出人ZP3基因cDNA片段,然后将其克隆在pUC18质粒上,并对克隆片段进行序列分析。结果：共克隆到ZP3-A（1300bp）、ZP3-B（1180bp）、ZP3-C（1200bp）和ZP3-D（1080bp）4种不同长度的人ZP3基因cDNA片段,对其中最长的ZP3-A片段的测序结果表明,它包含了人ZP3基因阅读框内的全部序列,与NCBI Sequence Viewer中公布的人ZP3 mRNA序列（NM-007155）相比较,在1275bp长的编码区内只有一个碱基不同,两者同源性达到99．92％。结论：本研究克隆到的ZP3-A cDNA片段确是人ZP3基因无疑。     

新基因人MOB cDNA的克隆与功能分析

人MOB基因被认为是在脑组织中高表达的5次跨膜而功能未知的膜蛋白.从胎儿和成人肾脏消减杂交cDNA文库中获得了一条新的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）序列,该序列对应于功能未知的MOB基因.利用生物信息学分析工具和分子生物学技术,从胎儿肝脏中成功地克隆了人MOB基因cDNA序列,同时也获得了含有完整开放读码框的大鼠和鸡MOB的电子全长序列.人MOB基因定位于10q11.1～11.2之间,含有一个1 242 bp的开放阅读框,第415位开始的ATG可能是翻译起始位点.核酸序列相似性搜索发现,其他种属中存在与之高度相似的EST序列,如爪蟾（79%）、羊（87%）、猪（94%）、牛（93%）.蛋白质序列相似性搜索发现,人MOB与大鼠、小鼠和鸡MOB有97%、97%、91％的相似性,与其他一些不同种属来源的假想蛋白有45%～73%的相似性.不同物种之间MOB基因核酸和蛋白质序列的高度相似说明,MOB是进化上高度保守的蛋白质.保守结构域分析发现,人、小鼠、大鼠和鸡MOB结构域组成完全一致,N端均与不育α基序（sterile alpha motif,SAM）结构域显著匹配,随后出现匹配显著性稍差的几个结构域.核酸和蛋白质序列的保守性提示,除N端约70个氨基酸组成SAM结构域外,其余的保守氨基酸可能形成一个新的保守的MOB结构域.表达谱分析表明,人MOB基因在所有被检组织和细胞中都表达.亚细胞定位研究显示,人MOB广泛表达于细胞内,主要在细胞核.DNA含量测定结果表明,人MOB基因过表达并不影响HeLa细胞的细胞周期和凋亡.总之,人MOB蛋白是一个在多种组织和细胞中广泛表达、细胞内广泛分布、进化上十分保守的蛋白质,可能通过特定蛋白质之间的相互作用,参与多种发育过程的调节.其过表达不影响HeLa细胞的周期和凋亡.     

人核糖核酸抑制因子基因在人脐血干细胞中的转染表达及对小鼠黑色素瘤基因治疗的研究

探讨人核糖核酸抑制因子 (hRI)基因在人脐血干细胞中的转染及表达情况 ,及转染后对小鼠B16黑色素瘤生长的影响。用免疫磁珠分离系统 (MACS)分离纯化人脐血CD34⁺ 细胞后 ,用制备的含hRI基因的逆转录病毒上清转染脐血CD34⁺ 细胞 ,采用克隆形成法和PCR法检测转染效率 ,Western blot和免疫荧光法检测基因表达 ,同时观察RI对荷瘤C57BL小鼠B16黑色素瘤生长的影响。应用MACS能高度纯化人脐血CD34⁺ 细胞 ,使分选后的脐血CD34⁺ 细胞纯度平均达96.15%。hRI基因能够转染到脐血CD34⁺ 细胞上 ,转染效率达 35% ,Western blot和免疫荧光检测转染后CD34⁺ 细胞hRI基因有阳性表达。经转hRICD34⁺ 细胞治疗 ,使小鼠B16黑色素瘤的生长速度减慢 ,成瘤率和瘤重降低 ,成瘤潜伏期延长。     

人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆及蛋白表达

目的：在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型（HPV6）L1的融合蛋白。方法：PCR方法扩增HPV6 L1,基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6mLI,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果：酶切和测序结果证实HPV6 mL1基因的原核表达载体构建正确;以1mmol／L IPTG于37℃诱导4h,蛋白以包涵体形式表达;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为80000。结论：获得大肠杆菌表达的HPV6L1蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供了基础。     

多发性骨髓瘤细胞株ARH—77恶性相关基因hMMTAG2的克隆和序列分析

为从人类多发性骨髓瘤细胞株中克隆新的恶性相关基因 ,构建人类多发性骨髓瘤细胞株ARH 77cDNA文库。从ARH 77细胞中提取mRNA并逆转录合成双链cDNA ,经PCR扩增后 ,插入表达载体 ,得到ARH 77细胞cDNA表达文库。将文库菌落印迹至尼龙膜 ,分区培养提取质粒DNA ,建立基因池 ,并分别转染NIH/ 3T3细胞。经G418筛选并计集落数 ,选择克隆数最多的基因池进入第二轮。如此反复进行。通过测序 ,排除所有已知的癌基因、抑瘤基因、细胞因子及其受体 ,获得了有转化活性的cDNA克隆A6 2 17。进一步使用RACE技术对 5′端进行快速扩增 ,获得全长为 130 0bp的cDNA序列 ,该基因由 8个外显子组成 ,编码产物为 2 6 3个氨基酸组成的多肽链。将该基因暂时命名为多发性骨髓瘤转化基因 2 (tumor associatedgene 2fromhumanmultiplemyeloma ,hMMTAG2 )。该基因定位于人类染色体 1q42 .13。生物信息学分析发现 ,hMMTAG2编码有多个蛋白激酶的磷酸化位点、N 肉豆蔻酸化位点及核定位信号 ,提示该基因的表达产物可能是细胞核内的一种信号分子。     

重组人超氧化物歧化酶的基因克隆、表达及产物纯化研究

为了克隆人SOD-cDNA,构建表达载体,实现其在大肠杆菌中的高效稳定表达,通过抽提人肝组织总RNA,RT-PCR扩增人SOD cDNA,构建含rhSOD cDNA的表达质粒pLY-4/rhSOD,转化大肠杆菌JF1125进行表达研究。结果克隆到的rhSOD cDNA序列与文献报道一致,在宿主菌中获得高效表达,表达水平达68%以上;蛋白复性纯化工艺高效快速,rhSOD纯品纯度达98%以上,比活性达到2529u/mg;为用基因工程方法生产rhSOD打下基础。     

衰老对2种猕猴血液基因表达的影响及与人类的对比

衰老是导致免疫功能和代谢活动下降的危险因素.作为最常用的非人灵长类动物模型,猕猴属Macaca被用来探索与衰老过程相关的因素.为了比较2种猕猴和人类在衰老过程基因表达变化的异同,本研究收集比较了3个物种的血液转录组.在藏酋猴M.thibetana(TM)、普通猕猴M.mulatta(CR)和人类中分别获得了2523个、...