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1.
目的构建针对P27的siRNA腺病毒载体及相应的对照病毒载体,并鉴定重组腺病毒在小鼠胰岛中对内源性皿7基因表达的影响。方法合成针对p27的siRNA的靶DNA序列及相应的阴性对照序列,连接至pShuttle-H1质粒中,然后用NotI和HindHI限制性内切酶将H1-siRNA片段从pShuttle—H1-siRNA质粒上双酶切下来,克隆至空载pAdTrack穿梭质粒上,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染QBI-293A细胞,包装得到pAd—P27-siRNA和pAd—NC重组腺病毒。用病毒体外感染小鼠胰岛,Western印迹法检测P27蛋白表达水平。结果重组腺病毒载体经测序鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能有效抑制小鼠胰岛中P27的表达。结论成功构建了针对P27的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究P27在胰岛β细胞生长中的作用提供了基础。 相似文献
2.
目的构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体,并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响,为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具。方法人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA;在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染表达MKRN1的HeLa细胞株,用RT-PCR法及Western印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响,用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化。结果成功构建了MKRN1的siR-NA重组腺病毒载体;MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达,并显著上调细胞中端粒酶的活性。结论构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性,从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具。 相似文献
3.
目的构建人MEKK3基因的小干扰RNA(siRNA)重组腺病毒载体表达载体,观察其在胃腺癌AGS细胞中对MEKK3的表达抑制。方法设计并合成针对人MEKK3基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluI及XhoI克隆入pRNAT—H1.1/Adeno穿梭载体中,得到的质粒用Pme I线性化后在大肠埃项菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组。卡那霉素筛选后,用PacI酶切鉴定。鉴定正确的质粒经Pac I酶切、乙醇沉淀后转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd—MEKK3-siRNA重组腺病毒。病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞,Western印迹法检测其对MEKK3蛋白表达的抑制。结果酶切和洲序鉴定表明3个MEKK3 siRNA重组腺病毒表达载体正确无误。Western印迹检测结果显示3个pAd—MEKK3-siRNA重组腺病毒表达载体中有两个可有效地抑制胃腺癌AGS细胞中MEKK3基因的表达,其中以pAd.MEKK3-siRNA3的抑制作用最显著,有效率达89%。结论成功构建了针对MEKK3基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究MEKK3基因在人胃腺癌AGS细胞中的作用和功能奠定了基础。 相似文献
4.
设计并合成针对人MEKK2基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,将合成的互补片段退火后克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,并使其在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组。将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒。病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞,Western blot印迹法检测其对MEKK2表达的抑制。经酶切和测序鉴定均证实pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误。Western blot印迹检测结果显示,重组腺病毒表达载体可抑制MEKK2基因的表达,以pAd-MEKK2-siRNA2(针对MEKK2 cDNA 992-1 010的片段)抑制效果为最佳,pAd-MEKK2-siRNA1(针对MEKK2 cDNA 1 456-1 474的片段)和pAd-MEKK2-siRNA3(针对MEKK2 cDNA 1 351-1 369的片段)则未见明显的抑制效果。DNA Ladder和细胞存活测定结果表明,敲减MEKK2的表达后,AGS细胞接受H2O2刺激后的凋亡受到较强抑制、细胞存活数增加,明显高于野生型细胞和转导siRNA阴性对照腺病毒细胞接受H2O2刺激后的,差异具有统计学意义(P〈0.05),而后两者之间差异无统计学意义(P〉0.05)。该研究成功地构建了针对MEKK2基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步深入研究MEKK2基因在人胃腺癌细胞中的作用和功能奠定了基础。 相似文献
5.
构建携带针对大鼠维甲酸受体β(Retinoic acid receptorβ,RARβ)基因的siRNA重组腺病毒,并感染全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)处理的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),检测其对RARβ的表达及MSCs成神经分化的影响。设计针对大鼠RARβ的4对siRNA的DNA序列,体外退火形成双链,定向克隆至含有U6/H1双启动子的腺病毒穿梭质粒pSES-HUS,随后与腺病毒骨架质粒pAd-Easy1在BJ5183细菌中同源重组,并在HEK293细胞中包装获得重组腺病毒Ad-siRARβ。腺病毒感染大鼠MSCs后经ATRA处理24 h,Real-time、Western blotting及免疫荧光检测RARβ的表达情况。改良神经诱导培养基(Modified neuronal induction medium,MNM)诱导MSCs神经分化,Real-time PCR及免疫荧光检测神经相关蛋白表达。PCR、酶切及测序鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,腺病毒感染大鼠MSCs后可观察到60%以上的细胞有红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达。经ATRA处理24 h,Real-time、Westernblotting及免疫荧光检测发现RARβ表达定位于细胞核,ATRA作用后MSCs中RARβ表达增高16.5±2.34倍(P<0.05),有3组siRNA能有效抑制ATRA诱导的RARβ表达增强,抑制率分别为(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%(P<0.05),且以pool组效果最强,抑制率为(78.09±4.24)%(P<0.01)。ATRA联合MNM诱导MSCs成神经样细胞,表达相关神经特异蛋白Nestin、NSE、MAP-2、Tau,免疫荧光结果显示神经标志蛋白Nestin、NSE、Tju1表达阳性细胞率为(50-88)%,而腺病毒介导的siRARβ能有效抑制MSCs的神经标志物表达水平及阳性细胞率(P<0.05)。成功构建了携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,能有效感染MSCs并显著抑制ATRA诱导的RARβ表达增强和MSCs的神经分化。 相似文献
6.
应用两个RNA干扰实验技术网络的RNA设计软件,模拟SD大鼠晚期糖基化终产物受体(RAGE) mRNA的二级结构,设计针对RAGE mRNA417、221和534位点的3对小干扰RNA(siRNA)序列(21nt),再转化为能表达其小发夹结构RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,分别将其克隆于pGCsi-U6/Neo/GFP载体,利用酶切和序列分析鉴定克隆的正确性。将RAGE特异性siRNA表达克隆转染肝星状细胞(HSC)-T6细胞系,以空白及转染非特异性siRNA表达克隆作为对照,分别以实时荧光定量PCR和Western印迹法检测各组HSC-T6细胞RAGE基因和蛋白质的表达。结果显示:成功构建了RAGE特异性siRNA重组表达载体pGCsi-R1、pGCsi-R2、pGCsi-R3和非特异性siRNA重组表达载体pGCsi-C,与对照组相比,转染特异性siRNA重组表达载体的HSC-T6细胞的RAGE mRNA表达受到明显抑制,在0.25~1.0nmol/L范围内,RAGE mRNA下调幅度呈浓度依赖性增加,以1.0nmol/LpGCsi-R1最显著,转染pGCsi-C的HSC-T6细胞的RAGE mRNA表达水平无明显变化。转染pGCsi-R1的HSC-T6细胞24、48和72h表达的RAGE mRNA分别较空白对照组下调(79.65±8.88)%、(78.96±7.94)%和(73.11±6.89)%(F=71.397,61.824,61.98,P均<0.01),在72h范围内,RAGE mRNA下调幅度呈时间依赖性降低。同时,转染pGCsi-R1的HSC-T6细胞50kDa和46kDa的RAGE、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA及蛋白质的表达也明显下调,分别为空白对照组的(43.91±1.18)%(F=386.19,P<0.01)、(36.33±0.78)%(F=386.07,P<0.01)、(57.53±3.25)%(F=20.91,P<0.05)和(58.48±3.08)%(F=56.59,P<0.05)。结果表明:pGCsi-R1表达的特异性siRNA可高效抑制HSC-T6细胞中RAGE基因和蛋白质的表达及肝星状细胞的激活。 相似文献
7.
目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能.方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定.通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒栽体pGsadeno-Notch1-shRNA.经PacI线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒.产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质千细胞,RT-PCR和Western blot 检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确.重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平.对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31%和86.97%,具有统计学意义(P<0.05).结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础. 相似文献
8.
目的:Visfatin是由内脏脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子,它能够发挥拟胰岛素作用,并能促进脂肪细胞的分化、合成及积聚,与糖脂代谢有着密切的联系,但其确切生理功能及作用机制仍有待进一步研究.本实验成功构建了visfatin ShRNA腺病毒载体,并验证其对Hepal-6细胞visfatin mRNA表达的影响.旨在为进一步研究visfatin在影响糖脂代谢方面的作用机制提供一个简便可行的分子生物学研究平台.方法:将前期构建的pGenesil l.2-visfatin质粒双酶切,得到目的片段mU6-visfatinShRNA,克隆入穿梭质粒pShuttle-Basic-EGFP,I-CeuI+I-SceI双酶切后转入pAdxsi载体,经筛选、鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,包装后得到腺病毒Adxsi-GFP-mU6-visfatin,病毒颗粒法(viral particle,vP)和半数组织感染量法(50%tissue culture infective dose,TCID50)测定其滴度.感染hepal-6细胞后,实时定量PCR检测visfatin的mRNA表达.结果:经酶切及测序鉴定,结果与预期一致.VP法检测病毒滴度为3.20× 1012 VP/mL,TCID50法测得滴度为2× 1011PFU/mL.重组病毒感染后,对小鼠Hepal-6细胞visfatin基因mRNA表达抑制率>70%.结论:成功构建了visfatin ShRNA重组腺病毒载体,并能有效抑制小鼠Hepal-6细胞visfatin基因表达,为后期进一步研究visfatin在糖脂代谢方面的作用机制提供了一个基因表达下调的生物学模型. 相似文献
9.
利用双链RNA(dsRNA)调控基因表达已经成为研究基因功能的有力工具。用人H1启动子构建了pBS/H1PS小干扰RNA(siRNA)表达载体,用于在哺乳动物细胞中产生特异性dsRNA转录产物。通过对293细胞中的PSMA7分子进行表达抑制,证明该siRNA载体能够有效产生针对靶基因的RNA干扰(RNAi)效应。 相似文献
10.
目的:获得敲低效果较好的CCCTC结合因子(CTCF)的RNA干扰腺病毒载体,以便于研究其在肿瘤发生发展中的作用。方法:从已发表文献中获得CTCF敲低靶序列,合成2对含有小发卡结构的寡核苷酸序列,将其进行退火磷酸化后,分别克隆到腺病毒包装载体上;将重组质粒转染人胚肾293A细胞,收获腺病毒;将收获的腺病毒分别感染人胚肾HEK293细胞和靶细胞人肺腺癌细胞A549,通过RT-PCR和Western印迹鉴定相关基因的表达变化。结果与结论:RT-PCR和Western印迹鉴定显示构建的表达CTCF短发夹RNA(shRNA)的腺病毒载体能够有效抑制CTCF转录和蛋白水平,为后续CTCF的生物学功能和机制研究奠定了基础。 相似文献
11.
Advanced glycation end products (AGEs) formed from glyceraldehyde (Gcer) and glycolaldehyde (Gcol) are involved in the pathogenesis of diabetic complications, via interactions with a receptor for AGEs (RAGE). In this study, we aimed to elucidate the RAGE-binding structure in Gcer and Gcol-derived AGEs and identify the minimal moiety recognized by RAGE. Among Gcer and Gcol-derived AGEs, GLAP (glyceraldehyde-derived pyridinium) and GA-pyridine elicited toxicity in PC12 neuronal cells. The toxic effects of GLAP and GA-pyridine were suppressed in the presence of anti-RAGE antibody or the soluble form of RAGE protein. Furthermore, the cytotoxicity test using GLAP analog compounds indicated that the 3-hydroxypyridinium (3-HP) structure is sufficient for RAGE-dependent toxicity. Surface plasmon resonance analysis showed that 3-HP derivatives directly interact with RAGE. These results indicate that GLAP and GA-pyridine are RAGE-binding epitopes, and that 3-HP, a common moiety of GLAP and GA-pyridine, is essential for the interaction with RAGE. 相似文献
12.
探讨晚期糖基化终产物(AGE)修饰蛋白对内皮细胞生成白介素8(IL-8)的作用,及晚期糖基化终产物受体(RAGE)在此病理过程中的作用.内皮细胞来自培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC).将内皮细胞与不同浓度的AGE修饰人血清白蛋白(AGE-HSA)在体外共同培养,或以可溶性晚期糖基化终产物受体(sRAGE)对AGE-HSA进行预处理后再与HUVEC共同培养.用蛋白质液相芯片法检测HUVEC培养上清中IL-8水平,并提取细胞RNA,进行RT-PCR反应,检测细胞中IL-8 mRNA的表达水平.结果表明,AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式刺激HUVEC生成IL-8,未经修饰的HSA无此作用.AGE-HSA用sRAGE预处理后,刺激HUVEC生成IL-8的作用被抑制,并且此抑制作用呈剂量依赖的方式.AGE-HSA刺激HUVEC使IL-8 mRNA表达增高,未经修饰的HSA无此作用.sRAGE能够阻断AGE-HSA诱导HUVEC表达IL-8mRNA的作用.整个变化趋势与蛋白质水平一致.研究首次证实,AGE-HSA与细胞表面受体RAGE相互作用可刺激内皮细胞分泌IL-8,并上调IL-8 mRNA的表达.这为研究加速型血管病变的发病机制提供了新视角,也为治疗由AGE增多和潴留所引起的病理损害提供了新靶点. 相似文献
13.
As a serious metabolic disease, diabetes causes series of complications that seriously endanger human health. The liver is a key organ for metabolizing glucose and lipids, which substantially contributes to the development of insulin resistance and type 2 diabetes mellitus (T2DM). Exogenous fibroblast growth factor 1 (FGF1) has a great potential for the treatment of diabetes. Receptor of advanced glycation end products (RAGE) is a receptor for advanced glycation end products that involved in the development of diabetes-triggered complications. Previous study has demonstrated that FGF1 significantly ameliorates diabetes-mediated liver damage (DMLD). However, whether RAGE is involved in this process is still unknown. In this study, we intraperitoneally injected db/db mice with 0.5 mg/kg FGF1. We confirmed that FGF1 treatment not only significantly ameliorates diabetes-induced elevated apoptosis in the liver, but also attenuates diabetes-induced inflammation, then contributes to ameliorate liver dysfunction. Moreover, we found that diabetes triggers the elevated RAGE in hepatocytes, and FGF1 treatment blocks it, suggesting that RAGE may be a key target during FGF1 treatment of diabetes-induced liver injury. Thus, we further confirmed the role of RAGE in FGF1 treatment of AML12 cells under high glucose condition. We found that D-ribose, a RAGE agonist, reverses the protective role of FGF1 in AML12 cells. These findings suggest that FGF1 ameliorates diabetes-induced hepatocyte apoptosis and elevated inflammation via suppressing RAGE pathway. These results suggest that RAGE may be a potential therapeutic target for the treatment of DMLD. 相似文献
14.
目的 构建人MEK5基因的小干扰RNA(siRNA)重组腺病毒表达载体,观察其在胃腺癌SGC7901细胞中对MEK5的表达抑制.方法 设计并合成针对人MEK5基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluⅠ及XhoⅠ克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,将得到的重组穿梭质粒用PmeⅠ线性化后在大肠埃希菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组.将PacⅠ酶切鉴定正确的重组腺病毒质粒经乙醇沉淀后转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd-MEK5-siRNA重组腺病毒.病毒体外转导人胃腺癌SGC7901细胞,Western印迹法检测其对MEK5表达的抑制.结果 经酶切和测序鉴定均证实pAd-MEK5-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误.Western印迹检测结果显示pAd-MEK5-siRNA2可抑制MEK5基因的表达,其有效抑制率达75.5 %.结论本研究成功地构建了针对人MEK5基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步深入研究MEK5基因在人胃腺癌细胞中的作用和功能奠定了基础. 相似文献
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目的:构建上皮锌指蛋白4(Krüppel-like factor 4,KLF4)siRNA慢病毒载体并进行初步鉴定,为研究KLF4在宫颈细胞癌中的分子机制奠定基础。方法:利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则,设计4个RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的单链DNA oligo,然后退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证,测序结果经比对确认正确的克隆,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。收集上清液感染宫颈癌He La细胞,通过q RT-PCR及Western Blot鉴定KLF4 siRNA慢病毒干扰效果。结果:成功构建KLF4 siRNA慢病毒载体。KLF4 siRNA慢病毒感染He La细胞后,q RT-PCR及Western Blot测定结果显示,KLF4表达明显降低。结论:KLF4 siRNA慢病毒载体构建及包装成功,可有效抑制KLF4表达,为研究KLF4生物学功能奠定基础。 相似文献
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Advanced glycation end products (AGEs) are implicated in the development of diabetic complications via the receptor for AGEs (RAGE). We have reported that the 3-hydroxypyridinium (3HP)-containing AGEs derived from α-hydroxyaldehydes physically interact with RAGE and show cytotoxicity. Lactaldehyde (LA) is formed from a reaction between threonine and myeloperoxidase, but no LA-derived AGEs have been characterized. Here, we identify the structure and physiological effects of an AGE derived from LA. We isolated a novel 3HP derivative, 2-acetamido-6-(3-hydroxy-5-methyl-pyridin-1-ium-1-yl)hexanoate, named as N-acetyl-LAPL (lactaldehyde-derived pyridinium-type lysine adduct), from a mixture of LA with Nα-acetyl-L-lysine. LAPL was also detected in the LA-modified protein. LAPL elicited toxicity in PC12 neuronal cells, but the effect was suppressed by the soluble form of RAGE as a decoy receptor. Moreover, surface plasmon resonance-based analysis revealed that LAPL specifically binds to recombinant RAGE. These results indicate that LA generates an AGE containing the 3HP moiety and contributes to RAGE-dependent cytotoxicity. Abbreviations: AGEs: advanced glycation end products; RAGE: receptor for advanced glycation end products; 3HP: 3-hydroxypyridinium; LA: lactaldehyde; LAPL: lactaldehyde-derived pyridinium-type lysine adduct; BSA: bovine serum albumin; GLAP: glyceraldehyde-derived pyridinium; MPO: myeloperoxidase; HFBA: heptafluorobutyric acid; TFA: trifluoroacetic acid; HPLC: high performance liquid chromatography; LC-ESI-QTOF-MS: liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole time-of-flight-mass spectrometry; NMR: nuclear magnetic resonance; LA-BSA: lactaldehyde-modified bovine serum albumin; PBS: phosphate buffered saline, GST, glutathione S-transferase; SPR: surface plasmon resonance; OP-lysine: 2-ammonio-6-(3-oxidopyridinium-1-yl)hexanoate; GLO1: glyoxalase 1; MG, methylglyoxal 相似文献
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目的 筛选特异性沉默人的Twist基因的siRNA序列,构建siTwist腺病毒并在MG63及143B骨肉瘤细胞中进行功能鉴定.方法 体外退火获得4组siTwist双链DNA序列,克隆至含有Twist基因的pSOS-Twist质粒中获得pSOS-siTwist质粒,脂质体转染HEK293细胞,GFP检测筛选有功能的siTwist片段,将筛选出的siTwist序列构建腺病毒,感染143B骨肉瘤细胞.通过RT-PCR、Western 印迹检测Twist的表达.siTwist与Twist腺病毒共感染MG63骨肉瘤细胞,细胞计数及细胞侵袭实验检测siTwist对Twist的抑制作用.结果 在HEK293细胞中,4组siTwist中有2组GFP的表达明显降低,且siTwist腺病毒能抑制143B骨肉瘤细胞中内源性的Twist表达,Twist腺病毒能促进MG63骨肉瘤细胞的增殖和转移,而两组siTwist与Twist共感染组MG63细胞的增殖及迁徙率均明显低于Twist组(P〈0.05).结论 筛选出两对特异性沉默Twist基因的siRNA片段,并成功构建腺病毒,转染细胞后能有效抑制内源性和外源性的Twist表达,为研究Twist在骨肉瘤细胞增殖和转移中的作用及具体机制提供了有效的分子工具. 相似文献
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