斜纹夜蛾核多角体病毒几丁质酶基因的克隆及序列分析

以苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｔｉｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ,ＡｃＭＮ－ＰＶ）基因组含几丁质酶基因（ｃｈｉＡ）的ｐｓｔＩ Ｍ片段为探针,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交将斜纹夜蛾核多角体病毒（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ,ＳｐｌｔＮＰＶ）的ｃｈｉ     

斜纹夜蛾泛素基因的克隆及表达

泛素介导的蛋白质降解途径对脑内蛋白的选择性降解起着重要作用。设计一对简并引物,从斜纹夜娥(Spodoptera litura)细胞中克隆了泛素基因的编码区,CenBank登录号AF436066。序列分析表明,该编码区的长度为228bp,编码由76个氨基酸组成的、分子质量为8．56kD的蛋白,其等电点为6．56。同源性比较发现,斜纹夜峨泛素基因不仅与其它真核生物的泛素基因在氨基酸水平上具有96％以上的相似性,而且与斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltMNPV)泛素基因的同源性为84％。RT—PCR分析发现,泛素基因在所检测的斜纹夜蛾幼虫多种组织,尤其是脂肪体中均有表达。采用构建的原核表达载体pQEUB,在大肠杆菌M15中诱导并高效表达出了带有His—tag的重组融合蛋白,薄层扫描分析得知靶蛋白约占总蛋白的37％。利用Ni—NTA亲和层析胶纯化得到重组融合蛋白,经SDS—PAGE鉴定为单一区带,为进一步研究S．litura泛素在SpltMNPV感染中的作用打下了基础。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒p74基因的克隆和序列分析

用ＡｃＮＰＶｐ７４基因３’端的１．４ｋｂ片段,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ将ＳｐｌｔＮＰＶ的ｐ７４基因定位于ＸｈｏＩ（４．９ｋｂ）、ＥｃｏＲＩ（４．４ｋｂ）、ＢａｍＨＩ（３．０ｋｂ）片段上。进一步用ＥｘｏⅢ和构建亚克隆测序法,对长２５４５ｂｐ的ｐ７４基因进行,其中１９７４ｂｐ的编码编码６５８个氨基酸,蛋白分子量约７５．８７ｋＤ,其编码蛋白与ＡｃＭＮＰＶ和ＣｆＭＮＰＶｐ７４蛋白的氨基酸序列同     

斜纹夜蛾Cecropin D成熟肽的原核表达及活性检测

采用RT-PCR方法从斜纹夜蛾Spodoptera litura脂肪体组织中扩增得到了Cecropin D成熟肽基因序列,分析发现Cecropin D成熟肽与斜纹夜蛾Cecropin B之间存在2个氨基酸残基的差异。将获得的基因序列连接入原核表达载体pGEX-4T-1,并在原核细胞中实现了该蛋白的融合表达。SDS-PAGE结果表明,诱导后的宿主菌比未诱导菌中多出了一条融合蛋白表达带,诱导后1 h就可以检测到该蛋白,从诱导后1 h到5 h该蛋白在表达量上没有明显的差异。生长曲线显示在IPTG诱导后宿主菌的生长受到明显的抑制,纯化后的蛋白对细菌具有一定的抑制作用。     

斜纹夜蛾spli caspase-1部分基因的克隆与分析

紫外线、芹菜夜蛾核型多角体病毒(sfMNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)都可诱导斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)SL-1细胞凋亡,这说明在SL-1细胞中Caspase表达活性高,本实验从莲纹夜蛾(Spodoptera littoralis)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)序列出发,根据其中保守性高的序列设计引物,提取SL-1细胞中的总RNA,并进行逆转录和PCR扩增,获得了一条419bp的cDNA。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒p74基因的克隆和序列分析

用AcNPV p74基因3′端的1.4kb片段,通过Southern blotting将SpltNPV的p74基因定位于XhoI(4 .9kb)、EcoRI(4.4kb)、BamHI(3.0kb)片段上。进一步用ExoⅢ和构建亚克隆测序法, 对长2545bp的p74基因进行了序列分析,其中1974bp的编码区编码658个氨基酸,蛋白分子量约75.87kD,其编码蛋白与AcMNPV和CfMNPV p74蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%和63%。     

闹羊花素Ⅲ对斜纹夜蛾细胞系的活性及作用机理

研究了闹羊花素Ⅲ对斜纹夜蛾Spodoptera litura离体培养细胞（SL细胞）的活性,并测定了对SL细胞Na⁺、K⁺和葡萄糖吸收以及对4龄幼虫血细胞数量的影响。结果表明：以400 µg/mL 和200µg/mL闹羊花素Ⅲ处理SL细胞,24 h后细胞的相对死亡率为79.00% 和56.69%,处理后8 h,16 h,24 h和48 h的LC₅₀分别为240.09 µg/mL,173.45 µg/mL,113.56 µg/mL和73.40 µg/mL;闹羊花素Ⅲ处理SL细胞后10 min,细胞对离子的吸收迅速增加,30 min后吸收作用逐渐减弱;处理后3天内细胞对葡萄糖的吸收迅速增加,4～5 天后,细胞对葡萄糖的吸收基本停止。以叶碟法和注射法处理4龄幼虫,8 h后幼虫血细胞数量显著降低,随处理时间增加,幼虫血细胞数量又逐渐增加。     

斜纹夜蛾羧酸酯酶基因的克隆、序列分析及表达水平

为了明确斜纹夜蛾Spodoptera litura对溴氰菊酯产生抗性的分子机理, 本研究利用RT-PCR技术和RACE方法获得了1个斜纹夜蛾羧酸酯酶基因的全长cDNA序列, 命名为Slest2。序列分析表明, 该cDNA全长1 796 bp（GenBank 登录号: DQ445461）, 5′和3′UTR区分别长63和119 bp,开放阅读框编码一个由537个氨基酸残基组成的羧酸酯酶蛋白。通过对氨基酸同源性分析表明, 该羧酸酯酶与其他物种的酯酶均具有很高的氨基酸相似性,并具有多个在不同酯酶蛋白家族中均保守的区域。采用实时定量PCR技术比较了Slest2在斜纹夜蛾抗、感品系中的表达水平。当以cDNA为模板检测mRNA转录水平时发现, Slest2在抗性品系中的转录水平是敏感品系的46.85倍; 以基因组DNA为模板检测Slest2基因的拷贝数时发现, Slest2在抗、感性品系中的拷贝数无显著差异（前者为后者的1.16倍）。这些结果表明, 抗性与敏感品系具有相似的Slest2基因拷贝数, 但它们在抗性品系中的转录水平显著升高。由此推测Slest2基因的转录水平升高与斜纹夜蛾对溴氰菊酯的抗药性密切相关。     

草地贪夜蛾与斜纹夜蛾解毒相关基因的比较分析

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda近期在中国为害猖獗,由于繁殖速度快,迁飞能力强,在本土呈现爆发趋势,严重为害了我国农作物。与本地近缘物种斜纹夜蛾Spodoptera litura相比,草地贪夜蛾更偏好玉米、水稻、小麦等禾本科农作物,且对多种化学杀虫剂及转基因Bt玉米产生抗性。寄主适应性以及杀虫剂抗性与解毒代谢相关蛋白密切相关。因此,本研究对这两种夜蛾科害虫的解毒代谢相关蛋白——细胞色素P450、谷胱甘肽转移酶(GST)及ABC转运蛋白进行了全基因组水平系统的搜集和数目比较,构建系统发育树并对P450和GST部分基因扩张分支进行氨基酸差异位点分析。结果显示,在草地贪夜蛾中共鉴定出213个P450基因、58个GST基因、102个ABC基因,其中P450基因与GST基因数目远远多于斜纹夜蛾(116,37),而ABC基因数目与斜纹夜蛾(99)接近。系统发育树分析表明,草地贪夜蛾P450在CYP6、CYP9以及CYP4功能簇,GST在部分进化分支上都发生了显著基因扩张,发生显著扩张的基因中有数个氨基酸突变,其中一些突变被预测可能影响蛋白质功能。但出乎意料的是,ABC亚家族B和E在斜纹夜蛾聚集成簇并发生了显著的基因扩张现象。以上结果暗示入侵种草地贪夜蛾和本地近缘物种斜纹夜蛾在抗性方面可能发展出各自独特的应对机制。本研究为解析草地贪夜蛾解毒抗性特征机制提供基因数据,为草地贪夜蛾的生物防治及抗性研究提供参考依据。     

斜纹夜蛾核多角体病毒几丁质酶基因上游4.0kb的序列分析

本文报道了斜 诳蛾核多角体病毒几丁质酶基因（chiA）上游约4.0kb范围内的序列,它包括了六个读码框（ORF1－6）,其长度分别为156bp、279bp、540bp、369bp、1281bp和228bp,可编码的氨基酸长度分别为51、98、179、122、426和75个,分子量分别为6.15kD、11.46kD、21.70kD、14.69kD 、47.59kD和9.09kD。在ORF1ORF2、ORF3起始密码前分别有一个、二个及一个杆状病毒早期启动子基序CAGT;在ORF4、ORF5起始密码前各有一个及二个杆状病毒晚期启动子基序TAAG。在ORF1、ORF4、ORF5终止密码下游有真核生物mRNA转录poly（A)加尾信号。ORF4为AcMNPV ORF53、BmNPV ORF42、OpMNPV ORF56、LdMNPV ORF54的同源基因。ORF1、ORF2、ORF6与已知的杆状病毒基因沿有同源性,可能为三个新的基因。     

Laboratory evaluation of flight activity of the common cutworm, Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae)

Abstract  The flight activity of Spodoptera litura in tethered conditions is evaluated using a computer-mediated flight-mill in the laboratory. The 3–4-day-old moths fly longer and farther than those of other ages. Male and female moths exhibit similar flight activity. Mating status does not influence the flight duration and distance of 2-day-old females. However, these two flight parameters with a 6-day-old mated female is significantly lower than that of unmated ones. The optimum temperature for flight ranged from 16–24°C, whereas the optimum RH ranged from 60%–100%. During 72-h period, the total flight duration and distance of 1-day-old male and female moths were 19.6 h (± 5.8) and 83.3 km (± 28.4), and 24.0 h (± 7.0) and 105.4 km (± 37.4), respectively. These results indicate that S. litura has a great potential to undertake long-distance migratory flights.     

斜纹夜蛾铁硫亚基蛋白的表达及功能鉴定

铁硫亚基蛋白(rieske iron-sulfur protein, RISP) 是线粒体复合物Ⅲ的关键蛋白亚基之一, 在呼吸链电子传递过程中起到重要作用。本研究通过RT-PCR克隆得到斜纹夜蛾Spodoptera litura RISP基因SlitRISP的ORF, 构建了pET32a-SlitRISP原核表达载体, SDS-PAGE和Western blot检测结果显示, SlitRISP原核表达蛋白以包涵体的形式存在于菌体沉淀中, 且RISP抗体可成功用于该蛋白的免疫印迹检测。为了进一步鉴定SlitRISP在斜纹夜蛾离体细胞系SL-1中的功能, 通过向细胞内转染siRNA, 利用RNAi技术沉默SL-1中的SlitRISP。qRT-PCR结果表明, 分别经50 nmol/L和100 nmol/L siRNA处理48 h后, SL-1中SlitRISP的表达均几乎完全被抑制; Western blot结果显示, SL-1中SlitRISP含量显著低于CK。当SL-1 SlitRISP被成功沉默后, 通过检测SL-1线粒体膜电位、 细胞ATP含量和细胞增殖抑制率鉴定RISP在线粒体电子传递过程中的重要作用。流式细胞仪测定结果表明, 经50 nmol/L和100 nmol/L siRNA处理24 h后, SL-1线粒体膜电位相对于CK分别降低23.52%和11.32%, 而处理48 h后, SL-1线粒体膜电位则分别升高5.58%和27.66%; siRNA处理24 h和48 h后, SL-1 ATP含量相对于CK分别降低82.71%和84.50%, 最终导致SL-1细胞增殖抑制率分别为53.64%和67.94%。这些结果表明SlitRISP在SL-1中参与线粒体膜电位的形成和细胞ATP的合成。介于RISP在线粒体电子传递链中的重要作用, 其可能成为新型杀虫作用靶标, 这可为研制新型呼吸抑制剂提供参考。     

Effect of plant secondary metabolites on common cutworm,Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae)

The effect of various flavonoids, lectins and phenyl β‐_D‐glucoside on larval survival, weights and the activities of digestive (total serine protease and trypsin) and detoxifying (esterase and glutathione‐S‐transferase) enzymes of Spodoptera litura larvae at 7 days after treatment was studied through diet incorporation assay. Flavonoids (rutin, chlorogenic acid, quinic acid, caffeic acid, naringenin, quercitin, kaempferol, myricetin, catechin, and ferulic acid) were incorporated in artificial diet at 100, 500 and 1000 ppm, lectins: groundnut leaf lectin (GLL), concavalin A (ConA) and phenyl β‐_D‐glucoside at 1, 2 and 5 μg/mL. Flavonoids such as rutin, quercitin and kaempferol at 1000 ppm were more toxic to S. litura larvae than quinic acid, caffeic acid, naringenin, myricetin, catechin, and ferulic acid. Larval growth and development were significantly reduced in S. litura larvae fed on a diet with GLL and ConA at 5 μg/mL compared to the larvae fed at 2 and 1 μg/mL concentrations. The larvae fed on flavonoid‐treated diets showed significant reduction in serine protease, trypsin and esterase activities. The flavonoids such as rutin, chlorogenic acid, quinic acid, naringenin, quercitin, kaempferol and myricetin, and lectins, GLL and ConA can be utilized in insect control programs.     

斜纹夜蛾中肠糖代谢相关基因的克隆及表达模式分析

斜纹夜蛾Spodoptera litura是一种世界性分布的重要农业害虫, 在生长发育过程中要经历幼虫 蛹的变态发育过程。由于变态发育前后昆虫的食性发生了明显的改变, 作为食物消化吸收的中肠也发生了解体和重建。与此相适应, 昆虫中肠的各种物质和能量代谢也可能会相应地发生改变。为研究斜纹夜蛾中肠变态发育过程中糖代谢途径的变化情况, 我们从斜纹夜蛾中肠EST文库中鉴定出了12个糖代谢相关基因, 克隆了其中3个基因的全长cDNA, 并应用半定量PCR和定量PCR的方法检测了其在幼虫 蛹变态发育期中肠组织的转录表达以及对激素和饥饿等因素的响应情况。结果表明： 这3个基因（α-L-岩藻糖苷酶、 N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶和烯醇化酶基因）的开放阅读框分别为1 461, 1 200和1 299 bp, 预测的分子量分别为56.3, 43.3和46.7 kDa。这12个糖代谢相关的基因在变态发育期的中肠组织中具有5种不同的mRNA表达模式： （Ⅰ）只在幼虫期高表达（唾液麦芽糖酶前体蛋白、 糖基水解酶31家族成员蛋白、 线粒体乙醛脱氢酶、 β-1,3 葡聚糖酶基因）; （Ⅱ）只在预蛹期高表达（β-葡萄糖醛酸酶、 β-N-酰基氨基葡萄糖苷酶3基因）; （Ⅲ）只在蛹期高表达（葡萄糖胺-6-磷酸异构酶基因）; （Ⅳ）在预蛹期和蛹期高表达（α-葡萄糖苷酶、 α-淀粉酶、 N-乙酰葡糖胺 6 磷酸脱乙酰酶和α-L-岩藻糖苷酶基因）; （Ⅴ）在变态发育期恒定表达（烯醇化酶基因）。这说明, 为适应变态发育斜纹夜蛾中肠糖代谢途径发生了明显的改变。保幼激素对这些基因的表达没有明显的影响, 但蜕皮激素对Ⅰ类基因（如糖基水解酶31家族成员蛋白基因）具有一定的抑制作用, 对Ⅲ类基因（如葡萄糖胺-6-磷酸异构酶基因）有显著的上调作用。此外, 我们还发现饥饿对几乎所有这些基因的表达都有显著的抑制作用。这些结果说明, 昆虫中肠变态发育过程中糖代谢相关基因的动态变化可能受到蜕皮激素以及饥饿相关因素的共同调控。这一研究对从代谢角度揭示昆虫变态发育的分子机理具有重要意义。     

Cloning and expression of apolipophorin-III from the common cutworm,Spodoptera litura

We have cloned apolipophorin-III (apoLp-III) cDNA from adult fat body of Spodoptera litura. The sequence encodes a 188 amino acid polypeptide including a 22 amino acid leader peptide. The circular dichroism spectrum from the purified apoLp-III indicated a considerable content of α-helix. Sequence alignment showed that S. Litura apoLp-III has a relatively high degree of sequence identity with the apoLps-III of lepidopteran, Manduca sexta (72%), Galleria mellonella (67%), Bombyx mori (60%). These alignments with four lepidopteran apoLps-III showed highly identical residues and conservative replacements at a degree of 86%. Levels of mRNA from last instar larval fat body and adult fat body were compared through Northern blot analysis using ³²P-labeled 704 bp apoLp-III cDNA probe. A 850 bp mRNA was detected in both stages and mRNA level of day 1 adult fat body was much higher than that of last instar larval fat body. The tissue-distribution of apoLp-III mRNA in adult ovary and testis was also examined and we confirmed the presence of apoLp-III mRNA in ovary and testis although apoLp-III was expressed in these tissues at very low levels compared with the adult fat body. Arch. Insect Biochem. Physiol. 39:166–173, 1998. © 1998 Wiley-Liss, Inc.     

杀菌剂丙环唑对斜纹夜蛾的毒性

在研究比较了11种农药对斜纹夜蛾Spodoptera litura细胞（简称SL细胞）的毒杀活性基础上,选择毒杀活性最高的杀菌剂丙环唑,对其毒理学机理进行进一步研究。结果表明,丙环唑的细胞毒力最高,在100 μg/mL浓度下处理后48 h,SL细胞的死亡率为98.08％。处理后36 h,丙环唑对SL细胞的LC₅₀值为20.31 μg/mL。丙环唑能明显降低SL细胞的蛋白质含量。以0.5 μg/头的丙环唑注射斜纹夜蛾4龄幼虫,处理后72 h,试虫血淋巴总含量及血细胞数分别下降了26.80％和25.26％;在1.0 μg/头的剂量下,则分别下降了37.67%和36.32%。以0.5 μg/头和1.0 μg/头的丙环唑注射处理后,斜纹夜蛾幼虫体重显著降低。此外,丙环唑能降低斜纹夜蛾幼虫血淋巴含糖量及血淋巴蛋白质含量。在注射处理后96 h和120 h,丙环唑对斜纹夜蛾4龄幼虫的LD₅₀值分别为0.59 μg/头和0.45 μg/头。丙环唑对SL细胞和斜纹夜蛾幼虫均具有较好的毒杀活性,显示出丙环唑类似物控制害虫的可能性。     

Identification and localization of two sensory neuron membrane proteins from Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae)

Sensory neuron membrane proteins (SNMPs), which are located on the dendritic membrane of olfactory sensory neurons (OSNs), are proposed to be associated with odor reception in insects. Recent studies have demonstrated that SNMP1 is essential for electrophysiological responses of OSNs to the sex pheromone, cis‐vaccenyl acetate (cVA) in Drosophila melanogaster. To investigate the function of Lepidoptera SNMPs, we cloned two SNMP genes, SlituSNMP1 and SltiuSNMP2, from Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Sequence alignment and phylogenetic analysis showed that both genes bear the general characteristics of SNMPs, including six conserved cysteine residues and two transmembrane domains. Further expression profile experiments showed that SlituSNMP1 is mainly expressed in the antenna, while SlituSNMP2 is broadly expressed in various tissues. By in situ hybridization experiments, it was found that SlituSNMP1 expressing cells are surrounded by the SlituSNMP2 expressing cells in the pheromone sensitive sensilla, suggesting different functions of the two SNMPs in insect olfaction.     

植物气味化合物与斜纹夜蛾性信息素的协同作用

为提高现有性信息素对雄蛾的引诱活性, 本研究通过大量的田间试验探索植物气味化合物与斜纹夜蛾Spodoptera litura性信息素（顺9, 反11-十四碳二烯乙酸酯∶顺9, 反12-十四碳二烯乙酸酯=10∶1）的协同作用机制。从斜纹夜蛾寄主植物和花的气味化合物中, 选择9种有代表性的化合物, 并以一定剂量分别加入到斜纹夜蛾性信息素诱芯中, 在田间测试对雄蛾的引诱活性。结果表明: 在测试的9种植源性化合物中, 发现一定剂量(每个诱芯加入0.4 mg)的苯乙醛(PAA), 具有显著提高斜纹夜蛾性信息素的引诱作用, 而高剂量的苯乙醛则强烈抑制性信息素的引诱活性; 此外, 其他各种浓度的测试化合物或混合物对性信息素则没有统计上显著的增效作用。不同剂量的苯乙醛单个化合物及各种植物气味化合物组成的混合物对斜纹夜蛾也有微弱的引诱作用。苯乙醛必须要与性信息素的完整组分(以10∶1比例混合的顺9, 反11-十四碳二烯乙酸酯和顺9反, 12-十四碳二烯乙酸酯)混合才能起作用, 缺少顺9, 反12-十四碳二烯乙酸酯则没有引诱活性。本研究证明, 苯乙醛作为理想的性信息素诱芯增效剂, 可应用于建立更理想的斜纹夜蛾性信息素诱杀技术, 对性诱害虫防治和测报具有应用价值。     

甜菜夜蛾过氧化氢酶cDNA序列克隆、 序列分析和表达特征

过氧化氢酶 (catalase, CAT)作为生物体内的重要物质, 其主要功能是参与活性氧代谢过程, 在清除H₂O₂、 超氧自由基和过氧化物以及阻止羟基自由基形成等方面发挥着重要作用。本研究利用RT-PCR技术和RACE方法首次克隆和分析了甜菜夜蛾Spodoptera exigua （Hübner）CAT基因, 命名为SexiCAT, GenBank登录号为JN051294, 其cNDA序列全长为1 755 bp, 开放阅读框长1 524 bp, 推测编码507个氨基酸。经氨基酸序列比对, 此多肽序列具有高度保守性, 与其他昆虫CAT的序列一致性分别为： 家蚕Bombyx mori （87%）、 黑腹果蝇Drosophila melanogaster （73%）、 埃及伊蚊Aedes aegypti （71%）和赤拟谷盗Tribolium castaneum （70%）。对该基因在甜菜夜蛾各个发育时期以及不同组织表达量的荧光定量PCR分析表明, SexiCAT基因在甜菜夜蛾各个发育阶段的表达水平存在显著差异, 其中成虫期的表达量最高, 是卵期表达量的7倍, 幼虫期次之, 卵期最低; SexiCAT基因在5龄幼虫体壁、 中肠、 脂肪体和马氏管组织中都有表达, 但在脂肪体中表达量最高。甜菜夜蛾SexiCAT基因的成功克隆及同源建模将为今后对其功能研究以及作为靶标设计新型氧化酶抑制剂提供了基础。