低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞pHi及细胞增殖、凋亡的影响

目的: 探讨低氧肺血管结构重建时是否伴有PASMCs凋亡.方法: 体外低氧培养大鼠PASMCs,BCECF法测定细胞内pH值、光镜及电镜观察细胞形态、流式细胞仪测细胞周期、原位细胞凋亡(TUNEL法)观察细胞凋亡.结果: PASMCs在低氧早期即出现细胞内碱化,低氧6 h即出现G0/G1期细胞比例减少,G2/M期细胞比例增加,至24 h丝裂活动最强,但细胞凋亡率无显著变化.结论: 低氧PASMCs在细胞内碱化、细胞增殖的过程中不伴有细胞凋亡的改变.     

尾加压素对常氧及低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞周期的影响

目的：观察新近发现的缩血管活性肽人类尾加压素Ⅱ（human urotensin Ⅱ,hUII)对体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs)周期的影响。方法：体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞,加入不同浓度（mol/L)的hUII(10^-7,10^-8,10^-9),在常氧及低氧条件下孵育12h,用流式细胞术碘化丙啶染色法,分析PASMCs DNA直方图细胞周期时项、细胞增殖指数及凋亡亚二倍体峰的改变,以初步观察hUII对PASMCs增殖与凋亡的影响。结果：hUII呈浓度依赖方式促进PASMCs的增殖,主要表现为细胞周期S期的百分比增加,细胞增殖指数（PI）增高,常氧作用比低氧作用更明显。hUII浓度（mol/L)为10^-7,10^-8,10^-9时,与PASMCs常氧作用12h,PI分别比对照组增加了的175％、135％、118％;低氧作用12h,PASMCs PI分别是对照组的135％、118％、103％,hUII浓度为10^-7mol/L时作用最明显。同时DNA直方图分析各浓度范围的hUII均未见PASMCs凋亡亚二倍体峰出现。结论：hUII以剂量依赖方式刺激常氧及低氧PASMCs S期DNA合成速率,使PI增高,提示hUII具有明显的促PASMCs增殖作用。     

低氧对肺动脉平滑肌细胞PDGF mRNA表达的影响

应用原位杂交技术,研究了低氧对单层培养的猪肺动脉平滑肌细胞血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ）－Ａ和－Ｂ链ｍＲＮＡ表达的影响。用全自动图像分析仪检测两组细胞ＰＤＧＦ－Ａ和－Ｂ链杂交产物的平均光密度值。结果表明：常氧条件下无血清培养的肺动脉平滑肌细胞ＰＤＧＦ－Ａ和－Ｂ链ｍＲＮＡ表达阳性颗粒稀少,低氧条件下血清培养的肺的动脉平滑肌细胞ＰＤＧＦ－Ｂ链ｍＲＮＡ表达阳性颗粒明显增多,较密集地分布于整个细胞内,为常     

慢性间歇性低氧降低急性缺氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞膜上电压门控性钾通道的抑制

为了从离子通道水平上探讨机体低氧适应的离子机制,本实验将雄性 SD 大鼠随机分为常氧对照组和慢性间歇性低氧组[氧浓度(10 ± 0.5) %, 间断缺氧每天 8 h]。用酶解法急性分离单个大鼠肺内动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smoothmuscle cells, PASMCs),以全细胞膜片钳技术记录 PASMCs 膜上的电压门控性钾通道 (voltage-gated potassium channel, KV) 电流,观察急性缺氧对慢性间歇性低氧大鼠 PASMCs 的 KV 的影响, 为机体适应低氧能力提供实验依据。结果显示:⑴常氧对照组在电流钳下,急性缺氧可使膜电位明显去极化(由-47.2 ±2.6 mV 去极到 -26.7 ±1.2 mV ); 在电压钳下, 急性缺氧可显著抑制 KV电流( 60 mV 时, KV电流密度从 153.4 ± 9.5 pA/pF降到 70.1 ± 10.6 pA/pF), 峰电流的抑制率为(57.6 ± 3.3) %, 电流-电压关系曲线向右下移。⑵慢性间歇性低氧组KV电流密度随低氧时间延长而逐渐减少(慢性低氧10 d后就有显著性意义),电流- 电压关系曲线逐渐右下移。⑶急性缺氧对慢性间歇性低氧大鼠PASMCs KV电流的抑制作用随慢性间歇性低氧时间延长而逐渐减弱。上述观察结果提示慢性间歇性低氧减弱急性缺氧对 KV 的抑制, 这可能是机体低氧适应的一种重要机制。     

氯化钴诱导低氧与气体低氧对大鼠原代肺动脉平滑肌细胞增殖作用的比较研究

该研究比较了氯化钴(cobalt chloride, CoCl₂)诱导低氧与气体低氧对大鼠原代肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)增殖及氧化应激的影响。采用不同剂量(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L) CoCl₂诱导细胞或将细胞置于低氧培养箱中,通过MTT、CCK-8和EdU检测比较CoCl₂诱导低氧与气体低氧对大鼠原代PASMCs增殖的影响,并通过Western blot、流式细胞术比较CoCl₂诱导低氧与气体低氧对低氧敏感蛋白低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)表达量和细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)含量的影响。结果显示,CoCl₂或气体低氧刺激细胞24 h均可增加PASMCs增殖活力、HIF-1α蛋白表达量和ROS含量。气体低氧下PASMCs增殖活力显著...     

低氧对培养的不同内径的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的和方法：分离培养三种不同内径的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）,用^3H－TdR掺入速率和细胞计数作为细胞增殖的指标,观察低氧对其增殖作用的影响。结果：低氧对三种不同内径的PASMCs（内径分别为＞1000μm、500－800μm、300-400μm）增殖促进作用显著不同,其^3H－TdR掺入速率和细胞计数分别增加23.5％和11.1％、60.0％和33.8％、141.4％和52.0％,选择对低氧最敏感的PASMCs（内径为300－400μm）,进一步探讨低氧促PASMCs增殖作用的细胞机制：钙拮抗剂verapail、蛋白激酶C抑制剂staurosporine(Stau)和细胞Na-H交换抑制剂amiloride可显著降低低氧情况下PASMCs^3H－TdR掺入速率和细胞计数。结论：低氧对三种不同内径的PASMCs增殖促进作用显著不同; Ca^2 、蛋白激酶C和Na^2 －H^ 交换的激活,可能是低氧促PASMCs增殖的重要胞内信息转导机制。     

低氧促进大鼠肺动脉平滑肌细胞Periostin表达及其信号转导机制

观察低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）Periostin表达的影响及其相关信号转导机制。胶原酶I法原代培养PASMCs,经低氧（5％O2）分别处理PASMCs2,6,12,24h后,RT-PCR和Western blot法检测Periostin mRNA和蛋白表达。加入PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002（10μmol／L）进行干预,Western blot分析比较不同条件下低氧处理24h后大鼠PASMCs中Periostin和Akt／P-Akt的蛋白表达。结果表日月,与常氧组比较,低氧处理6h组、12h组和24h纽Periostin mRNA和蛋白的表达均显著上升（P〈0．05,P〈0．01）,低氧处理后的PASMCs中Periostin mRNA和蛋白的表达逐渐升高：低氧处理2h组无显著差异（P〉0．05）。用LY294002对PASMCs处理,并低氧24h后,Periostin的表达被显著抑制（P〈0．01）,细胞P-Akt的表达下调（P〈0．05）,总Akt的蛋白表达没有明显差异（P〉0．05）。推测低氧可诱导大鼠PASMCs中Periostin mRNA和蛋白的表达上调。低氧可能通过激活P13K/Akt通路促进Akt的磷酸化,进而使Periostin在PASMCs中过表达,提示Periostin在低氧性PASMCs增殖过程中可能起着重要作用。     

大鼠肺动脉平滑肌细胞钙激活氯通道电流的电生理检测

目的：研究大鼠肺动脉平滑肌细胞钙激活氯通道电流的电生理特性。方法：膜片钳全细胞和膜内向外记录模式检测大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活氯通道全细胞电流和单通道电流。结果：大鼠肺动脉平滑肌细胞记录到稳定的钙激活氯通道电流（ICl（Ca））;ICl（Ca）表现出典型的外向整流特性和电压时间依赖性激活。结论：大鼠肺动脉平滑肌细胞膜上存在电压、时间依赖性氯通道电流,钙激活氯通道通过促进肺动脉平滑肌细胞去极化而成为调节肺动脉特性的关键调节因子。     

低氧条件下大鼠肺动脉平滑肌细胞中活性氧与低氧诱导因子-1α和细胞增殖的关系

在低氧条件下,观察大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的变化,探讨ROS的变化是否通过调控低氧诱导因子-4α（hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α）的表达影响PASMCs的增殖。采用组织块法原代培养大鼠PASMCs,分成3组：常氧组（21％O2,24h）,低氧组（5％O2,24h）,低氧＋Mn-TBAP组（5％O2,24h,Mn-TBAP是一种ROS清除剂）。用激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内ROS的变化;用RT-PCR和免疫组织化学方法分别测定HIF-1α mRNA和蛋白的表达;用MTT法检测细胞增殖程度。结果显示：（1）低氧组PASMCs内ROS水平明显高于常氧组（P〈0．05）,低氧＋Mn-TBAP组ROS水平明显低于低氧组（P〈0．05）,但仍高于常氧组（P〈0．05）;（2）低氧组及低氧＋Mn-TBAP组的HIF-1α mRNA和蛋白表达均高于常氧组（P〈0．05）,且低氧组表达高于低氧＋Mn-TBAP组（P〈0．05）;（3）低氧组细胞增殖明显高于常氧组和低氧＋Mn-TBAP组（P〈0．05）,低氧＋Mn-TBAP组细胞增殖高于常氧组（P〈0．05）。结果表明：在低氧条件下大鼠PASMCs中ROS水平明显升高,RROS的变化能够调节HIF-1α的表达,进而影响平滑肌细胞的增殖,提示ROS可能在肺动脉高压的发病机制和低氧信号转导中具有重要作用。     

急性低氧对肺动脉,肾动脉及肠系膜动脉平滑肌张力的影响

对离休大鼠肺外、肾及肠系膜动脉血管环进行体外灌流,观察,急性低氧对平滑肌张力的影响。急性低氧（灌流液ＰＯ＿２４±０．７ｋＰａ）１０—１５ｍｉｎ对肺外和肠系膜动脉环静息张力无明显影响;用苯肾上腺素（１０￣（－６）ｍｏｌ／Ｌ）或ＫＣｌ（３０ｍｍｏｌ／Ｌ）预激肺动脉后给予低氧亦不能明显改变预激肌张力。急性低氧对肾动脉环的肌张力影响较显著,低氧引起一随时间变化的收缩峰,复氧（通９５％Ｏ＿２＋５％ＣＯ＿２混合气体）后肌张力又呈先升高后下降的变化;苯肾上腺素或ＫＣｌ预激肾功脉环后给予急性低氧,张力增加较明显,５—１０ｍｉｎ后张力下降至较预激稳定值低,复氧后张力回复。用无钙灌流液灌流肾动脉标本可取消低氧对静息张力及ＫＣｌ预激后张力的影响。α受体拮抗剂酚妥拉明１×１０￣（－６）—５０×１０￣（－６）ｍｏｌ／Ｌ或钙拮抗剂维拉帕米１×１０￣（－６）—５×１０￣（－６）ｍｏｌ／Ｌ不能取消低氧对肾动脉的作用,但前者能抑制复氧肌张力增加。结果显示急性低氧对离体肾动脉平滑肌有直接作用。     

缺氧时肺动脉内皮细胞与肺动脉平滑肌细胞增殖的相互影响

血管内皮细胞和血管平滑细胞在结构和功能上关系密切,两者的相互在与血管舒缩笔血和壁结构。本文观察了培养的小牛肺动脉内皮细胞（ＰＡＥＣｓ）和肺动平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣＳ）缺氧时在细胞增殖方面的相互影响。ＰＡＳＭＣＳ常氧条件培养基（ＣＭ）可使ＰＡＥＣＳ的＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入降低约５８％,缺氧ＣＭ对ＰＡＥＣＳ的＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入无明显的抑制作用;ＰＡＥＣＳ的常氧ＣＭ使ＰＡＳＭＳ的＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入升高约６０     

低氧对人肺动脉平滑肌和人肺动脉内皮细胞中HMGB1及相关炎症因子表达的影响*

目的:探讨低氧时人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)和人肺动脉内皮细胞(HPAEC)的高迁移率族蛋白1(HMGB1)及相关受体和炎症因子表达,并检测HMGB1对两种细胞增殖、迁移活性的影响。方法:低氧(1%氧浓度,Hypoxia组)及常氧(Control组)条件下培养HPASMC和HPAEC,RealTime-PCR检测两种细胞HMGB1、TLR2、TLR4、TLR9、RAGE、CD24、IL-6 、TNF-a和CXCL8 mRNA等受体和炎性因子的表达。MTS法观察不同浓度HMGB1对HPASMC和HPAEC增殖的影响;划痕法观察HMGB1对HPASMC和HPAEC迁移的影响。结果:Hypoxia组HPASMC、HPAEC中HMGB1及RAGE mRNA表达量较Control 组明显升高(P＜0.05及0.01);Hypoxia组HPAEC中CD24及HPASMC中IL-6 mRNA表达明显增高(P均＜0.05)。MTS结果显示在345 pmol/L 剂量下 HMGB1明显抑制HPAEC的增殖(P＜0.01),而对HPASMC增殖无影响。划痕实验示HMGB1对HPASMC和HPAEC迁移无明显影响。结论:低氧诱导HPAEC、HPASMC 产生HMGB1;HMGB1通过抑制HPAEC增殖引起内皮屏障功能障碍;而低氧进一步刺激HPASMC产生炎症因子。     

大鼠肺动脉平滑肌细胞缺氧后STAT3活性变化与细胞增殖关系的研究

目的：探讨信号转导及转录活化因子3（STAT3）对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响及作用机制。方法：组织块法原代培养PASMCs,用AG490预孵育后进行缺氧处理,半定量RT-PCR,Westernblot法分别检测缺氧2h、6h、12h、16h、24h组STAT3酪氨酸活性水平变化;半定量RT-PCR检测缺氧条件下上述时相点c-mycmRNA水平变化;^3H-TdR掺入法观察缺氧条件下细胞增殖变化。结果：Western blot定量分析显示缺氧培养6h组STAT3酪氨酸磷酸化水平升高,12h组达高峰,16h略有下降;缺氧培养2h组c-mycmRNA表达升高,4h达高峰,6h下降,12h恢复至正常水平;^3H-TdR掺入法结果显示缺氧6h组细胞^3H-TdR掺入量的增加,并随缺氧时间延长变化更为显著。AG490抑制缺氧诱导STAT3酪氨酸磷酸化及c-mycmRNA表达。结论：①STAT3活化和c-myc表达参与缺氧PASMcS增殖;②在缺氧PASMCs增殖过程中STAT3上调c-myc表达。     

Fractalkine对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察fractalkine（FKN）对体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响。方法：体外培养大鼠PASMCs,加入不同浓度（10-^10、10-^9和10-^8 mol／L）的FKN处理12h、24h和48h,采用四唑盐（MTT）法检测细胞增殖,流式细胞术（FCM）检测细胞周期。结果：MTT试验显示FKN显著促进大鼠PASMCs增殖,此作用呈浓度依赖性。FCM分析显示FKN使S期细胞比例和增殖指数P1值增加。FKN处理PASMCs 12h后,其S期细胞比例和H值即出现增加,24h达高峰。结论：FKN呈浓度依赖方式促进大鼠PASMCs增殖。     

低氧对肺内小动脉平滑肌细胞血管紧张素转化酶活性和基因表达的影响

实验采用分离培养兔肺内小动脉平滑细胞,观察低氧对ＰＡＳＭＣ的血管紧张素转化酶活性和基因表达的影响。     

GW501516对低氧条件下肺动脉平滑肌细胞增殖的作用及其机制*

目的: 观察过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)激动剂GW501516对低氧原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响,并探讨其可能机制,为低氧肺血管重构的防治寻找新靶点。方法: 对照组PASMCs采用21%氧气培养,低氧组采用 3％氧气诱导PASMCs增殖,通过不同浓度的GW501516(10、30、100 nmol/L)低氧条件下孵育PASMCs 12、24、48 h筛选GW501516抑制低氧PASMCs增殖的最适浓度;选择100 nmol/L GW501516和(或)蛋白激酶B(AKT)激动剂SC79在低氧条件下孵育PASMCs 24 h,探讨GW501516抑制PASMCs增殖可能机制,通过CCK-8与BrdU试剂盒检测细胞增殖与DNA的合成,流式细胞仪分析细胞周期,实时定量PCR(RT-PCR)检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1,细胞周期蛋白激酶抑制蛋白p27(p27)mRNA的表达,Western blot检测PPARδ、总的和磷酸化蛋白激酶B(AKT)与糖原合酶激酶3β(GSK3β)的表达。结果: 与低氧组相比,不同浓度的GW501516(10、30、100 nmol/L)干预12、24、48 h后能够抑制低氧条件下PASMCs增殖与DNA的合成,且100 nmol/L GW501516抑制作用最强(P＜0.05或P＜0.01);与对照组相比,100 nmol/L GW501516干预PASMCs 24 h能够显著上调PPARδ的表达,而低氧可显著下调PPARδ的表达(P＜0.01);与低氧组相比,100 nmol/L GW501516干预24 h后能够显著抑制PASMCs增殖与DNA的合成(P＜0.01),增加处于G0/G1期的PASMCs比例,明显减少S期和G2/M期的PASMCs比例(P＜0.05 或P＜0.01),显著抑制Cyclin D1 mRNA的表达并促进p27 mRNA的表达(P＜ 0.01),显著抑制AKT与GSK3β磷酸化(P＜0.01),而与100 nmol/L GW501516低氧组相比,AKT激动剂SC79能够逆转100 nmol/L GW501516 上述作用(P＜0.05或P＜0.01)。结论: GW501516通过抑制AKT/GSK3β信号通路抑制低氧条件下PASMCs增殖。     

Rab6A GTPase contributes to phenotypic modulation in pulmonary artery smooth muscle cells under hypoxia

Previous studies have demonstrated that hypoxia can induce phenotypic modulation of pulmonary smooth muscle cells; however, the mechanisms remain unclear. The present study aimed to investigate the effect of the GTPase Rab6A-mediated phenotypic modulation and other activities of rat pulmonary artery smooth muscle cells (RPASMCs). We revealed that Rab6A was induced by hypoxia (1% O₂) and was involved in a hypoxia-induced phenotypic switch and endoplasmic reticulum stress (ERS) in RPASMCs. After 48 hours of hypoxia, the expression of the phenotype marker protein smooth muscle actin was downregulated and vimentin (VIM) expression was upregulated. Rab6A was upregulated after 48 hours of hypoxia, and the level of glucose-regulated protein, 78 kDa (GRP78) after 12 hours of hypoxic stimulation was also increased. After transfection with a Rab6A short interfering RNA under hypoxic conditions, the expression levels of GRP78 and VIM in RPASMCs were downregulated. Overall, hypoxia-induced RPASMCs to undergo ERS followed by phenotypic transformation. Rab6A is involved in this hypoxia-induced phenotypic modulation and ERS in RPASMCs.