SNF2家族新成员Ercc6l的cDNA克隆与表达分析(英)

SNF2家族蛋白在基因组复制、修复与表达中具有重要作用. 报道了SNF2家族新成员Ercc6l (excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 6-like)的cDNA克隆、特性与表达分析.通过表达序列标签（EST）搜索和组装,获得了cDNA全长4 002 bp的新基因Ercc6l(GenBank Acc.No AY172688),然后通过RT-PCR在小鼠胚胎心脏成功克隆了该基因.Ercc6l在小鼠基因组中由两个外显子和一个内含子组成,定位于X染色体,最大开放阅读框（ORF）编码一个含1 240个氨基酸的假定蛋白质.该假定蛋白质含有SNF2蛋白的8个保守基序（SNF2结构域）.通过与SNF2家族各亚家族的成员进行多重比对,初步确认Ercc6l属于ERCC6亚家族成员.将Ercc6l编码区克隆到pEGFP-C3然后转染HeLa,3T3 和B16细胞,融合蛋白主要定位于胞浆.BLAST搜索检索出69条小鼠EST与Ercc6l同源,这些EST主要来自胚胎和肿瘤组织.对小鼠不同发育时期的多种组织进行RT-PCR,发现Ercc6l在胚胎期强表达,出生产后表达显著下调.这些结果提示Ercc6l在胚胎发育和肿瘤发生中可能具有重要作用.     

铁皮石斛体细胞胚胎发生类受体激酶基因DoSERK的克隆和表达分析

为了解铁皮石斛(Dendrobium officinale)中的体细胞胚胎发生类受体激酶基因DoSERK 的功能,在转录组测序数据的基础上克隆了DoSERK 的全长cDNA。结果表明,DoSERK 与其他植物的SERK 高度同源,编码633 个氨基酸。生物信息学分析表明,DoSERK蛋白为亲水蛋白并定位于质膜,具有1 个信号肽、1 个富脯氨酸区域、1 个跨膜区、5 个富亮氨酸重复序列以及1 个保守的蛋白激酶活性结构域,属于SERK 蛋白家族成员。系统进化树分析表明,DoSERK 与同为兰科植物的文心兰(Cyrtochilum loxense)以及卡特兰(Cattleya maxima)的SERK 亲缘关系最近。组织表达分析表明,DoSERK 在铁皮石斛中广泛表达,以幼嫩小苗根部的表达量最高。这些说明DoSERK 除了可能参与铁皮石斛体胚发生过程以外,还参与其他生长发育过程。     

独一味苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

以独一味叶片为材料,采用RT-PCR和RACE方法克隆了独一味苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的全长cDNA,命名为LrPAL基因。测序结果表明,LrPA L基因全长2 298 bp,含有1个2 145 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码714个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树分析表明,独一味LrPAL与唇形科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。用 Real-Time PCR方法检测发现,LrPAL基因在独一味的叶中表达量最高,茎中表达量最少。研究结果推测,从独一味中克隆获得的苯丙氨酸解氨酶基因（LrPAL）是典型的PAL家族成员,在独一味各组织发育过程中具有重要功能。     

茶树开花相关基因家族的克隆及CsMFT基因的可变剪切分析

开花是植物从营养生长到生殖生长转变的关键过程,PEBP(phosphatidylethanolamine binding protein)蛋白家族在植物开花过程中发挥重要调控作用。该研究分别采用信息学分析及RT PCR方法,对茶树CsPEBP基因家族进行了鉴定、克隆和表达分析。结果表明：(1)成功克隆获得5个PEBP基因家族成员,并分别命名为CsATC、CsMFT、CsBFT、CsFT和CsTFL1,其长度为519~525 bp,分别编码172~174 个氨基酸残基,定位于5条不同染色体。(2)结构分析显示,该蛋白家族不同成员氨基酸序列的相似性高达72.7%,含39.88%~42.28%的自由卷曲,分属于3个亚家族,其亲缘关系与杨树最近。(3)亚细胞定位分析显示,CsATC、CsMFT、CsBFT定位于细胞质, CsFT定位于细胞核,CsTFL1定位于细胞质和细胞核。(4)转录组和荧光定量PCR分析显示,CsMFT基因在茶树不同组织部位和不同非生物胁迫响应下的表达量均高于其他基因;CsFT、CsATC、CsMFT基因在茶树花半开时的表达量最高。(5)启动子元件分析显示,该基因家族的启动子中含有大量的光响应元件和激素响应元件。(6)CsMFT基因存在可变剪切,有 525 bp和689 bp 两个不同长度的转录本。研究推测,该研究所克隆的5个茶树CsPEBP家族成员均参与了调控茶树的开花过程和茶树对多种逆境的响应,为茶树开花调控相关研究奠定了基础。     

滇水金凤花距发育相关基因ABP的克隆及表达分析

为探究滇水金凤(Impatiens uliginosa)ABP基因的结构和表达特征,该研究以滇水金凤为材料,采用RT-PCR 技术对滇水金凤ABP基因进行克隆,运用DNAMAN和MEGA对其所编码的蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析,并利用qRT-PCR分析ABP基因的时空表达模式。结果表明:(1)滇水金凤ABP基因的cDNA 全长为627 bp,编码208 aa,命名为IuABP基因,其蛋白具有Cupin超家族蛋白的典型结构。(2)同源性分析表明滇水金凤ABP基因的氨基酸序列与喜马拉雅凤仙花(I. glandulifera)、月季(Rose chinensis)、木薯(Manihot esculenta)等物种的同源性均达71%; 系统进化分析表明IuABP与喜马拉雅凤仙花(Impatiens glandulifera)聚为一支,亲缘关系最近。(3)qRT-PCR分析表明IuABP基因在滇水金凤花距发育的3个时期及2个部位均有表达。随着花距的发育,IuABP基因在滇水金凤花距檐部的表达量呈先下降后上升的趋势,在盛花期时达最高,而在花距距部的表达量逐渐下降。以上结果为进一步研究滇水金凤ABP基因在花距发育中的功能及其表达调控机制提供了一定的理论参考。     

蒺藜苜蓿MtbHLH148转录因子的克隆与转化及其功能分析

bHLH(Basic helix loop helix, bHLH)转录因子家族是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物生长发育和盐胁迫应答机制。该研究利用同源克隆的方法克隆蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的MtbHLH148基因,采用qRT PCR方法分析MtbHLH148基因在蒺藜苜蓿中的表达特性,构建超表达载体并通过农杆菌侵染法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),对转基因拟南芥的耐盐性相关功能进行分析研究。结果显示：(1)从蒺藜苜蓿中获得MtbHLH148基因,该基因cDNA全长1 343 bp,包含开放阅读框为603 bp,编码 201 个氨基酸,蛋白分子量22.7 kD,等电点为11.76;蛋白结构分析显示,该蛋白无跨膜结构域,无信号肽,为亲水性蛋白;含有精氨酸／赖氨酸残基的保守结构域和典型的bHLH结构域;二级结构以α 螺旋和无规则卷曲为主。(2)亚细胞定位表明,MtbHLH148蛋白定位在细胞核。(3)进化树分析表明,MtbHLH148与大豆(Glycine max)的亲缘性最近;启动子分析发现,该基因启动子区域含有光响应元件、MYB结合位点以及ABA应答元件ABRE,可能参与非生物胁迫。(4)qRT PCR分析发现,MtbHLH148基因在蒺藜苜蓿的茎中表达量最高,叶中表达量最低,且MtbHLH148基因受ABA(100 μmol/L)诱导并在盐胁迫(200 mmol/L NaCl)处理8 h内表达量上调,而在低温(4 ℃)处理时表达量明显下调。(5)成功构建超表达载体pCAMBIA3301 MtbHLH148并转化拟南芥获得16个抗性株系,经鉴定有12个过表达株系,其中表达量最高的转基因株系为OE8;对OE8株系耐盐性功能分析发现,转基因拟南芥植株的发芽率明显高于野生型,盐胁迫下转基因拟南芥的根长是野生型的1.5倍,表明其耐盐性得到了增强。研究表明,MtbHLH148基因可能在盐胁迫调节机制中具有一定的调控作用。     

黄瓜叶绿素降解关键酶基因CsPAO的克隆与分析

该研究以黄瓜“津春2号”cDNA为模板,采用RT PCR方法克隆得到黄瓜叶绿素降解关键酶(pheophorbide a oxygenase,PAO)基因(CsPAO),对其进行亚细胞定位观察,并采用实时荧光定量PCR技术和生物信息学技术,分析了CsPAO基因的表达模式及其编码蛋白的特性。结果表明：(1)CsPAO编码545个氨基酸,理论等电点为6.09,蛋白相对分子质量为61.02 kD。蛋白预测发现,黄瓜CsPAO属于不稳定蛋白,具有2个蛋白结合位点,且存在跨膜现象。(2)荧光定量PCR结果表明,CsPAO基因表达响应水杨酸(SA)、茉莉酸 (JA)和赤霉素(GA₃)的调控,在高温(42 ℃)和低温(4 ℃)处理下CsPAO基因的表达量显著上升并达到最高,但黑暗处理对CsPAO基因表达没有影响;在黄瓜不同组织中花的表达显著高于根、茎、叶、萼、须、果。(3)亚细胞定位结果表明,CsPAO蛋白定位于叶绿体内。(4)系统进化树分析显示,黄瓜CsPAO与葫芦科植物苦瓜、西葫芦、南瓜、笋瓜等亲缘关系较近。本研究结果为进一步揭示黄瓜叶绿素降解的分子机制奠定了基础。     

碎米荠超氧化物歧化酶基因家族成员的鉴定和分析

为了解碎米荠(Cardamine hirsuta)的SOD基因特征,对SOD家族成员的基因结构、染色体定位、系统进化关系进行了分析,对顺式作用元件和蛋白结构进行了预测,并利用qRT-PCR技术检测各家族成员的组织表达模式。结果表明,碎米荠基因组中共有10个SOD基因(ChSODs),包括6个Cu/Zn-SOD、3个Fe-SOD和1个Mn-SOD。编码的ChSODs蛋白有57~ 324个氨基酸,分子量为6 419.41~34 659.01 kDa,理论等电点为4.92~9.60;系统进化树分析表明,碎米荠的ChSOD与拟南芥的AtSOD的同源性较高;ChSODs在根、茎、叶中均有表达,且在叶中高表达,其中CARHR085500和CARHR256690在叶和茎中表达量较高;顺式作用元件预测表明,碎米荠SOD响应多种非生物胁迫,其中对ABA和低温胁迫较为敏感; ChSODs蛋白质的二级和三级结构具有差异性。这表明碎米荠SOD基因在抗氧化过程中发挥重要作用。     

小麦TaDRLea3 2基因的克隆及胁迫诱导表达分析

胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA蛋白) 是植物体中广泛存在的一类与渗透调节相关的家族蛋白,植物受非生物胁迫会大量表达。该研究采用同源克隆技术,从干旱诱导的小麦品种‘郑引1号’ (Triticum aestivum L.)中获得1个新的LEA3家族基因（ TaDRLea3 2）,该基因全长668 bp,编码区为570 bp,编码189个氨基酸。生物信息学分析表明该蛋白为亲水性蛋白,二级结构以α 螺旋为主,含有9个由11个氨基酸组成的保守结构域,为典型的LEA3蛋白,存在3个磷酸化位点,无信号肽结构域及跨膜结构域,可能定位于细胞质中;实时定量PCR结果表明, TaDRLea3 2基因受干旱、高盐、低温诱导表达,同时也受外源ABA诱导,推测 TaDRLea3 2为ABA依赖型 LEA3基因,以不同机制参与小麦对非生物胁迫的应答过程,为深入分析小麦LEA3家族蛋白的抗逆机制奠定了基础。     

茎用莴苣2个WRKYⅢ亚族转录因子基因的克隆与表达

为了揭示WRKYⅢ亚族转录因子基因在茎用莴苣不同生物学过程中的作用,该研究在茎用莴苣品种‘永安红’中克隆得到了2个WRKYⅢ亚族转录因子基因LsWRKY08和LsWRKY37,并对其进行了序列比对、进化树构建、qRT PCR分析、互作网络及启动子分析,为深入研究茎用莴苣WRKYⅢ亚族转录因子的功能、提高茎用莴苣的产量和品质奠定理论基础。结果表明：(1)LsWRKY08和LsWRKY37转录因子分别含有945和930 bp的开放阅读框,分别编码314和309个氨基酸。(2)qRT PCR分析表明,LsWRKY08基因在叶片中的表达量比在根和茎中的表达量高,其中在茎膨大过程中,其表达量逐渐降低,而在干旱、高温、低温、盐等非生物胁迫中的表达量均比对照提高,且LsWRKY08基因在SA处理中表达量较对照明显增加;LsWRKY37基因在根中的表达量比在叶和茎中高,其在茎膨大过程中的表达模式与LsWRKY08基因不同,LsWRKY37基因在不同非生物胁迫下的表达模式存在差异。(3)互作网络分析发现,LsWRKY08和LsWRKY37可与植物防御相关蛋白以及其他转录因子存在互作;启动子鉴定发现,LsWRKY08和LsWRKY37基因启动子区存在多个顺式作用元件,其中LsWRKY37启动子含有W box元件,表明LsWRKY37可能与其他WRKY转录因子之间存在自我调节和交叉调节。研究认为,LsWRKY08和LsWRKY37基因能响应不同非生物胁迫以及激素处理,但2个基因之间表达模式存在差异,推测同一亚族的转录因子基因功能可能存在差异,且LsWRKY08和LsWRKY37转录因子可通过与其他蛋白相互作用或受其他基因调控来参与不同的生物学过程。     

向日葵MADS-Box基因HAM23-like克隆和表达分析

为了解MADS-box基因在向日葵(Helianthus annuus)花发育过程中的作用,采用RT-PCR技术克隆了1个MADS-box基因新成员HAM23-like,开放阅读框为831bp,编码276个氨基酸,相对分子量为30.52k D,理论等电点为9.42。系统发育分析表明,HAM23-like与拟南芥的AGL18聚于同一分支,具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析表明,HAM23-like基因在花和成熟果实(籽粒饱满期)中的表达量较高;HAM23-like在开花当天的雄蕊中的表达量最高;随着花的发育,HAM 23-like表达量逐渐升高,在开花后5 d (果实形成早期)达到最高表达水平。因此,推断HAM23-like基因可能与向日葵花器官后期发育和瘦果早期发育相关。     

陆地棉PIP亚家族基因的克隆及表达特征分析

该研究以陆地棉苯基香豆满苄基醚还原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase,PCBER)氨基酸序列为探针,利用Blastp从陆地棉基因组数据库中发现了6个同源性较高的基因。根据6个基因序列设计引物,利用RT-PCR技术从陆地棉纤维细胞中克隆出了这6个基因的全长cDNA序列,分别命名为GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3、GhIFR、GhPLR1和GhPLR2。多重序列比对和进化树分析发现,6个蛋白均含有PIP类型蛋白的所有保守性基序和活性残基,属于PIP亚家族。实时荧光定量PCR结果显示,除GhPLR1之外其他5个PIP亚家族基因均在纤维细胞中优势或特异表达;在纤维发育过程中,GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3和GhIFR的表达均表现为先上升后下降,GhPCBER1和GhPCBER2在花后21d表达量达到最高,GhPCBER3和GhIFR在花后18d达到最高,GhPLR1和GhPLR2在纤维中的表达量呈持续上升趋势。根据基因的表达特征,推测PIP亚家族可能在棉纤维的发育过程中发挥着重要作用。     

巴西橡胶树importin和exportin基因的克隆及其乙烯响应规律分析

为了解巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中importin和exportin基因的功能,采用RACE技术从巴西橡胶树中克隆了他们的c DNA全长,分别命名为Hb IMP和Hb XPO。结果表明,Hb IMP全长4170 bp,编码1115个氨基酸;Hb XPO全长4108 bp,编码1081个氨基酸。Hb IMP和Hb XPO分别与importin5和exportin1A亚家族的同源性最高。Hb IMP包含18个外显子,17个内含子,而Hb XPO包含30个外显子,29个内含子,且在上游调控序列中都存在乙烯响应元件ERELEE4和LECPLEACS2。在无乙烯刺激情况下,Hb IMP和Hb XPO在根、茎、叶、皮中有表达,但在胶乳中几乎检测不到表达;乙烯处理后Hb IMP和Hb XPO在胶乳中被明显诱导表达。因此,推测Hb IMP和Hb XPO参与了乙烯诱导蛋白出入细胞核的转运。     

甘菊木质素调控转录因子ClSND1-like的克隆与表达分析

为了探索纤维特异表达的NAC类转录因子SND1(secondary wall-associated NAC domain protein1,SND1)在甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)生长发育及非生物胁迫中的作用,该研究从甘菊中克隆了ClSND1-like基因,并对其进行生物信息学、亚细胞定位及表达模式分析。结果发现:(1)ClSND1-like基因的编码区全长1185 bp,共计编码394个氨基酸,是一个不稳定的亲水性蛋白,与除虫菊基因亲缘关系较近。(2)亚细胞定位结果表明,ClSND1-like基因在叶中不表达,在茎的导管壁上特异表达,属于木质素特异表达基因。(3)实时荧光定量PCR结果发现,ClSND1-like基因在茎中表达量最高,在根和叶中表达量极低,且随着茎秆的老化,表达量逐渐升高;在渗透胁迫和盐胁迫中表达量均显著提高。研究推测,ClSND1-like基因与甘菊木质素形成相关,并参与调控植物生长及盐和渗透胁迫。该结果为ClSND1-like基因在甘菊生长和非生物胁迫抗性中的研究奠定了基础,也为菊属植物的生长及抗性研究提供了新思路。     

Reference gene selection for RT-qPCR analysis of Chrysanthemum lavandulifolium during its flowering stages

Quantitative real-time RT-PCR (RT-qPCR) is a technology that can be used to analyze the abundance of gene expression. Reference genes, which are assumed to remain at constant levels in different tissues at various developmental stages and photoperiodic treatments, were selected to analyze the expression levels of flowering time genes and floral development genes. Using digital gene expression technology, nine reference genes with moderate expression in the leaves of Chrysanthemum lavandulifolium at the juvenile phase (CK1) and the squaring stage (W1) were selected as the candidate reference genes for further study. A total of 115 biological samples of C. lavandulifolium were analyzed, including different tissues under various developmental stages and leaves with varied photoperiodic treatments. The stability of the nine reference genes was slightly variable across the samples, but MTP, SKIP16 and PGK were the most stable genes overall. In addition, the relative expression level of ClFT in different tissues of plants with the competence to flower was analyzed to verify the reference genes selected in this study. These studies provide a guide for selecting reference genes for analyzing the expression pattern of flowering time genes and floral development genes in C. lavandulifolium.     

滇水金凤SAUR基因的克隆及表达分析北大核心CSCD

SAUR(small auxin up RNA)作为植物主要生长素诱导基因之一,其在促进植物细胞分裂和细胞伸长方面发挥重要的调节作用。该研究以滇水金凤(Impatiens uliginosa Franch.)为材料,采用RT-PCR等技术克隆SAUR基因,并进行生物信息学分析及基因表达分析。结果表明:(1)成功获得6个SAUR基因,其cDNA序列全长分别为351、534、396、333、309和411 bp,分别编码116、177、131、110、102和136个氨基酸。(2)生物信息学分析显示,除SAUR3为稳定蛋白外,其余5个均为不稳定蛋白;除SAUR5为疏水性蛋白外,其余均为亲水性蛋白;所有蛋白均为非分泌蛋白;6个SAUR基因编码的氨基酸序列与其他植物比对有较高的相似性,并具有一定的种属保守特征;推测SAUR4和SAUR5为旁系同缘,同时SAUR1、SAUR2、SAUR3和SAUR6为直系同缘。(3)RT-PCR分析发现,随着滇水金凤花的开放,6个SAUR基因表达量在花发育不同时期的檐部中均呈先上升后下降的趋势,始花期相对表达量最高,其次是盛花期,花苞期相对表达量均最低;各基因在花距的檐部和距部存在很大差异,其中SAUR3基因在2个部位均有非常高的表达;SAUR4、SAUR5和SAUR6基因在滇水金凤花距的基部和檐部具有相对高的表达,而其余3个SAUR基因在花距的尖部和弯部表达不明显。该研究结果为凤仙花属植物花距的生长发育调控机理、花型改良及新品种培育提供了一定的基础数据和科学依据。