DNA分析与扩增

931549利用毛细管系列电泳进~DNA.]II序[英3/Huang,X.C.…,Ahal.Chem.一1992,64(8)一.2149~2154[译自DBA,1992,11(23),92—12849] 一种DNA测序方法利用了毛细管系列电泳,双色荧光检测和双染料标记。在一系列毛细管上分离Sanger DNA测序片段,再用双色激光激发的confocal荧光扫描器进行桂上检测。在单个毛细管里分离出4套DNA测序片段,然后用双编码法进行区别,其中每套片段用两个有特定比率的染料标记的引物标记。这样就有可能筛选出电泳迁移率相同的染料l关键的是甩不同染料标记的DNA片段之间不应该出现电泳迁移的差异,而且染料具…     

GFP/DNA双标记法流式细胞仪分析荧光补偿调节方法的建立

用PI或Hoechst 33342标记表达GFP基因的BGH 823细胞DNA,流式检测分析时,需要做荧光补偿.以此为例,建立了线性(DNA含量)和对数(GFP表达量)放大信号之间的荧光补偿调节方法.结果表明,建立的补偿调节方法对于GFP/DNA双标记实验,完全适用和有效;它既实现了在同一散点图上同时呈现线性与对数放大,也提供了对数和线性2种不同荧光信号参数发生荧光重叠时进行补偿调节的方法.     

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性T淋巴细胞方法的探讨

用绿色荧光前体化合物Calcein AM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应.通过对一系列标记条件的研究:不同浓度Calcein AM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定CalceinAM荧光素标记法的最佳条件.用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb/c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E/T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65%.通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性.     

白菜rDNA及C-(0)t-1DNA的荧光原位杂交及其核型分析

以早熟白菜苔为实验材料,从其基因组DNA中分离出C0t-1 DNA并用生物素标记作探针,25S rDNA用地高辛标记作探针,对有丝分裂中期相染色体进行双色荧光原位杂交。每对染色体上均显示出了特定的C0t-1 DNA荧光原位杂交带型,5对染色体上显示出了25S rDNA荧光原位杂交带型。双色荧光原位杂交证实了C0t-1 DNA与25S rDNA二者具有一致的染色体位置特征,表明基于rDNA及C0t-1 DNA的荧光原位杂交核型分析技术,优于目前普遍采用的只基于rDNA的荧光原位杂交核型分析方法。结合C0t-1 DNA与25S rDNA的荧光原位杂交带型和传统的染色体的形态学标记分析方法及白菜已公布的基于rDNA分布的核型分析结果,创建了一个精确的白菜核型。     

疑难问题解答一例

问:在噬菌体侵染细菌的实验中,怎样知道进入细菌细胞的是噬菌体的DNA而不是蛋白质呢?答:噬菌体是有蛋白质的外壳包裹着DNA的简单结构.它侵染细菌时,进入细胞的是DNA还是蛋白质呢?美国科学家赫尔希(Hersher)和蔡斯(Chase)在1952年做了如下的实验回答了这个问题.他首先将噬菌体培养在含有用~(32)P同位素标记的磷酸盐培养基上,结果DNA被~(32)P标记.而蛋白质一般只是由C、H、O、N、S元素组成,而不含P,故蛋白质不会被标记.他又将噬菌体放在含有~(35)S同位素标记的硫酸盐培养基里培养,结果噬菌体的蛋白质被~(35)S标记上.而DNA没有被标记.     

秋水仙素诱导细胞周期停滞

DNA含量检测是流式细胞仪最早且目前仍然是其最为广泛的应用之一．原理是用荧光物质标记细胞DNA,流式检测的荧光强度即代表细胞内DNA的多少,由于细胞在不同时期的DNA含量的不同,故可以将细胞周期分为二倍体期（G0／G1期）,四倍体期（G2／M期）和S期（处于二倍体和四倍体间的过渡期）,通常用荧光染料PI（碘化丙啶,水溶性,488nm激发）标记细胞,然后用流式细胞仪进行检测,根据荧光的强弱判断检测的细胞在周期中不同时期的分布。     

梨自交不亲和基因cDNA芯片杂交条件优化及应用

[目的]优化梨自交不亲和基因(S-RNase或S基因)c DNA芯片杂交条件,利用芯片检测梨品种S基因型。[方法]提取梨品种雌蕊RNA,Cy3标记引物RT-PCR获得S基因荧光标记特异c DNA序列。设置不同杂交条件,用已知S基因型品种荧光标记的PCR产物在不同条件下分别与芯片杂交,杂交信号分析芯片杂交效果。用芯片优化杂交体系鉴定梨品种未知S基因型,DNA测序验证芯片鉴定结果。[结果]芯片杂交最佳条件:杂交温度42℃,杂交时间8~9 h,PCR纯化产物终浓度为200 ng·μl-1。优化杂交条件下芯片鉴定晚咸丰、秀水、丽江马占梨1、湘菊、木通梨、甘甜、弥渡小红梨、丽江大中古、金晶和弥渡火把等梨品种S基因型分别为:Pp S15Pp S52、Pp S4Pp S5、Pb S22Pp S37、Pp S1Pp S2、Pp S1Pp S3、Pp S13Pp S15、Pp S12Pb S42、Pb S21Pb S22、Pp S3Pp S60和Pp S5Pp S5。DNA测序验证各品种所含S基因与芯片鉴定结果一致。[结论]梨自交不亲和基因c DNA芯片优化杂交条件后可准确鉴定梨品种所含已鉴定的S基因资源。     

梨自交不亲和基因cDNA芯片杂交条件优化及应用北大核心

[目的]优化梨自交不亲和基因(S-RNase或S基因)c DNA芯片杂交条件,利用芯片检测梨品种S基因型。[方法]提取梨品种雌蕊RNA,Cy3标记引物RT-PCR获得S基因荧光标记特异c DNA序列。设置不同杂交条件,用已知S基因型品种荧光标记的PCR产物在不同条件下分别与芯片杂交,杂交信号分析芯片杂交效果。用芯片优化杂交体系鉴定梨品种未知S基因型,DNA测序验证芯片鉴定结果。[结果]芯片杂交最佳条件:杂交温度42℃,杂交时间8~9 h,PCR纯化产物终浓度为200 ng·μl-1。优化杂交条件下芯片鉴定晚咸丰、秀水、丽江马占梨1、湘菊、木通梨、甘甜、弥渡小红梨、丽江大中古、金晶和弥渡火把等梨品种S基因型分别为:Pp S15Pp S52、Pp S4Pp S5、Pb S22Pp S37、Pp S1Pp S2、Pp S1Pp S3、Pp S13Pp S15、Pp S12Pb S42、Pb S21Pb S22、Pp S3Pp S60和Pp S5Pp S5。DNA测序验证各品种所含S基因与芯片鉴定结果一致。[结论]梨自交不亲和基因c DNA芯片优化杂交条件后可准确鉴定梨品种所含已鉴定的S基因资源。     

特异性探针的使用

<正>为了用特异性探针检测检样中病原体的DNA,有必要使DNA相互反应形成双链DNA。在检测双链DNA时,必须预先标记特异性探针。有同位素标记和非同位素标记两种方法。用同位素标记者,在反应后洗去未反应的探针,仅测定放射强度便可。(图1)用非同位素法标记的DNA,在反应后,使之与碱性磷酸酶(ALP),过氧化物酶、β—D半乳糖苷酶等结合,以酶抗体法的原理检测杂交的DNA(图2)。由于最近市售一种与ALP直 (图1)用游离法杂交     

硒与红细胞血影收缩蛋白(Spectrin)作用导致构象变化

从人红细胞膜提取血影收缩蛋白(Spectrin),研究不同浓度Na_2SeO_3与其作用后的构象变化.用N—[3—芘]—马来酰胺(N-[3-P]M)作荧光探针标记Spectrin,经SDS处理后,其荧光强度随硒的浓度增加而逐步降低.但未经SDS处理的样品,加入0.2—1.0ppm的Na_2SeO_3后反而使荧光强度有所增加.Spectrin经硒作用与未经作用相比较在色氨酸内源荧光、丹磺酰氯(DNS-Cl)标记后(DNS-Spectrin)的荧光光谱以及色氨酸残基与DNS基团间的能量转移实验结果均有明显的差别.这反映Spectrin的巯基经与硒作用后会导致构象的变化.     

加拿大披碱草×野大麦三倍体杂种染色体的分子原位杂交鉴定

加拿大披碱草与野大麦 2个四倍体多年生禾草杂交产生的属间杂种F1为三倍体 (2n =3x =2 1) ,丢失了与亲本染色体基数相同的 7条染色体。为查明该杂种F1的染色体构成 ,应用基因组分子原位杂交方法 ,将父本(♂ )野大麦基因组 (H1H1H2 H2 )DNA用荧光生物素标记作为探针 ,以母本 (♀ )加拿大披碱草基因组 (SSHCHC)DNA作为封组 ,对杂种F1根尖细胞有丝分裂中期的染色体DNA进行原位杂交。结果表明 :三倍体杂种F12 1条染色体中 ,有 14条出现偏黄色荧光信号 ,来自父本 (♂ )野大麦H1H2 基因组有 7条出现橙红色荧光信号 ,来自母本 (♀ )加拿大披碱草S基因组、加拿大披碱草HC 基因组的 7条染色体丢失。     

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性T淋巴细胞方法的探讨

用绿色荧光前体化合物Calcein AM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应。通过对一系列标记条件的研究：不同浓度Calcein AM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定Calcein AM荧光素标记法的最佳条件。用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb／c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E／T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65％。通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性。     

用显微荧光术定量蚕豆染色体DNA

本文的目的在于探索一个简便而准确地测定单个染色体DNA含量的方法。作者选用蚕豆(Vicia faba,2n=12)根尖细胞做材料。第一步用Feulgen染色及显微吸收光度术测得该品种二倍体胞核DNA含量力36.15皮克(微微克,第二步用DNA特异性荧光染料——DAPI标记该细胞的染色体,然后在UNIVAR显微荧光计上测量各条染色体的荧光强度。经简单换算和统计学处理求得六对染色体DNA分布:9.27、5.03、4.71、4.47、4.26、3.91皮克(微微克)。     

基因标记、转化、表达与检测

920468采用生物素和一种荧光染料标记的引物对聚合酶链反应产物进行定t分析〔英万Landgraf,A.“·/A rtal.Bioehem。一1991,193(2)一231~235〔译自DBA,1991,10(12),91一06628〕 经生物素和异硫氰酸荧光素共价标记的PCR引物可被固定化分离。采用在5‘末端有不同标记的成对引物,可对PCR产物进行同步纯化和鉴定。产物经生物素标记,可用连有抗生物素蛋白或共类似物的吸附剂加以分离。对异硫氰酸荧光素标记的DNA引物进行碱变性和洗脱,即可定量测定荧光标记的吸人量。为测试实用性,用2个互补于人bcr外显子n的104bp靶序列的寡聚核普酸引物,…     

鱼类双重荧光标记研究——以中华倒刺鲃幼鱼为例

为探究盐酸四环素(TCH)和茜素红S(ARS)对中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis Bleeker)的影响及标记效果, 丰富鱼类荧光标记模式, 研究使用TCH(100—500 mg/L)和ARS(100—300 mg/L)对中华倒刺鲃幼鱼进行双重浸染荧光标记, 实验共设置5个处理组和1个对照组, 浸染时间均为24h。结果显示, 经90d的养殖实验后, 标记鱼的耳石(包括矢耳石和星耳石)、倒刺、鳍条和鳍棘均能检测到双重荧光标记环, 且TCH产生的黄色荧光环比ARS产生的红色荧光环更接近骨质结构内部。较高浓度处理组的矢耳石(≥300 mg/L TCH和≥150 mg/L ARS)、星耳石(≥300 mg/L TCH 和 ≥200 mg/L ARS)和倒刺(400—500 mg/L TCH 和150—300 mg/L ARS)中均能检测到明显的标记环(n≥2), 但所有处理组的侧线鳞和非侧线鳞的荧光标记不明显(0≤n≤1)。经200—500 mg/L TCH和150—300 mg/L ARS处理的鳍条, 及经300—500 mg/L TCH和200—300 mg/L ARS处理的鳍棘中可以同时检测到明显的TCH和ARS的标记环(n≥2)。此外, 在整个实验中各处理组标记鱼与对照组相比, 在生长和存活率方面均无显著性差异(P>0.05)。结果表明, 使用TCH和ARS双重标记中华倒刺鲃幼鱼是可行的。双重荧光标记方法在水生生物标记回捕实验及实验性生物学研究方面具有潜在的应用前景。     

4′6二脒基-2-苯基吲哚与DNA结合特性研究

本文以小牛胸腺DNA和λDNA为材料,首次用激光拉曼光谱研究了4’6二脒基—2—苯基吲哚(DAPI)与DNA的结合机制.认为DAPI是以非镶嵌的方式在DNA小沟中同DNA的AT碱基对此氢键结合.在低PH下,这种结合受到抑制,盐浓度的高低与DAPI-DNA复合体的荧光强度成负相关.     

4′6二脒基-2-苯基吲哚与DNA结合特性研究

本文以小牛胸腺DNA和λDNA为材料,首次用激光拉曼光谱研究了4’6二脒基—2—苯基吲哚(DAPI)与DNA的结合机制.认为DAPI是以非镶嵌的方式在DNA小沟中同DNA的AT碱基对此氢键结合.在低PH下,这种结合受到抑制,盐浓度的高低与DAPI-DNA复合体的荧光强度成负相关.     

幼体中国对虾荧光标记虾的制作

采用经过暂养,平均体长为2 cm以上的中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)进行试验,用黄色、红色和绿色荧光染料(visible implant elastomer,VIE)制作荧光标记对虾.结果表明,对照组中国对虾与用VIE标记后7个试验组中国对虾在生长发育等方面没有差异,并且各组对虾蜕皮正常.尽管荧光标记的残留率随着虾体的生长有所下降以及分布的不均匀,但荧光标记的保持率为95%.3种颜色的荧光染料中,红色荧光标记的效果最好.     

TP-M13自动荧光检测法在高粱SSR基因型鉴定中的应用

研究利用TP-M13自动荧光检测法对48份高粱材料进行了简单序列重复(SSR)标记的基因型鉴定.在这个方法中,需要合成一个普适性的用荧光(如FAM)标记的M13引物,并把M13的正向引物和一个SSR反向引物相连(称为TP-M13引物),利用3条引物序列进行PCR扩增,其PCR产物在DNA测序仪(如ABI3700仪)上进行自动荧光检测.结果表明,这种方法和其他的传统方法相比,具有经济、灵敏、高效的优点.建议在利用数量很多的SSR标记对数量有限的基因组较小的材料进行基因型鉴定时,使用TP-M13自动荧光检测系统.     

荧光原位杂交技术在染色体结构研究中的应用

1969年 Gall和 Pardue首先用同位素标记的 RNA探针定位特定的靶 DNA序列 ,开创了原位杂交技术 ,但同位素探针的高背景限制了它对靶序列的精确定位 ,随后发展了一系列非同位素方法 ,最初有生物素探针 ,用荧光素标记亲合素 ,酶联反应或胶体金检测 ,其他包括乙酰氨基荧光素 ( AAF) ,汞 ,地高辛 ( DIG)和 2 -三硝基酚等。荧光原位杂交 ( fluorescence in situ hybridiza-tion FISH)技术就是指将 DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记 ,通过原位杂交与靶染色体或 DNA上特定的序列结合的方法学 ,靶染色体通常固定在载玻片上 ,杂交结果用荧…