转基因水稻cry1Ab/Ac基因及蛋白在肉鸡肠道中的残留检测

旨在研究转基因水稻对饲喂肉鸡的影响,以含有转cry1Ab/Ac基因水稻的饲料饲喂肉鸡,分析了肉鸡空肠、回肠、盲肠、直肠中cry1Ab/Ac基因和蛋白残留情况,并用体外实验验证了外源基因的降解情况。结果表明,饲喂转cry1Ab/Ac基因水稻21 d和42 d的肉鸡肠道4个部位中没有检测到cry1Ab/Ac基因残留,体外消化外源基因的实验发现外源基因在肉鸡肠道中约4 h后开始逐步降解。对上述4个部位内容物进行ELISA和Western blot分析,均未检测到Cry1Ab/Ac蛋白残留。综合分析表明,转基因水稻中的外源基因和蛋白在肉鸡肠道中易被消化和降解。     

转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM030 4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94 μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果。     

水稻转基因植株后代中外源基因异常分离的研究

以用农杆菌介导法育成的日本晴等3个品种（系）的转基因水稻为材料,对外源基因的分离情况进行了研究。这几份转基因水稻都携带串联排列的抗虫基因cry1Ab和报告基因gusA等基因,在自交后代中,cry1Ab和gusA协同分离,但阳性植株与阴性植株之比都显著小于3：1,阴性植株显著偏多,以杂合转基因植株（gusA1-)作母本植株,与常规品种（-1－）杂交所得测交F1,阳性植株（＋／－）和阴性植株（－／－）的比例基本符合1：1,在反交时,阴性植株与阳性植株之比显著大于1：1的比例,比较日本晴转基因后代中gusA阳性株与阴性株的结实率发现,前者的结实率显著低于后者,综合上述结果可以看出,携带crylAb等转基因的花粉存在竞争劣势,可能是导致外源基因异常分离的主要原因。     

苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种HD-133 cry1D和cry1Ab mRNA含量及稳定性研究

苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种菌株HD－133含有代表性的三种cry1类基因cry1Ab,cry1C和cry1D,它们的表达量却明显不同。通过Northern杂交检测了菌株HD－133中基因cry1D和cry1Ab的mRNA含量及其稳定性。结果表明：基因cry1D mRNA的形成比基因cry1Ab的mRNA滞后3h,且基因cry1D形成mRNA的量很低,产生过程很平稳,在芽胞形成中期比cry1Ab mRNA低3．7倍;cry1Ab mRNA含量在芽胞形成前期高于后期,在后期仍能大量持续稳定地转录。cry1D mRNA的半衰期为18min,而cry1Ab mRNA的半衰期为14min。尽管cry1D mRNA比cry1Ab mRNA的半衰期更长,但cry1D和cry1Ab转录时间和转录量的差异是导致其表达量差异的重要原因。     

高粱ATP合成酶E亚基基因(SbATPase-E)的克隆及其抗逆功能研究

高粱是一种抗旱性较强的禾谷类作物。本研究在高粱中克隆到一个全长为693 bp的编码ATP合成酶E亚基的基因(SbATPase-E)。在高粱幼苗期,SbATPase-E基因受Na Cl和脱落酸(ABA)处理诱导上调表达。该基因在拟南芥中过量表达可提高转基因植株的耐旱性和耐盐性,在逆境胁迫条件下转基因拟南芥植株较野生型植株根系发达,可能是转基因植株耐旱性和耐盐性提高的主要原因。在干旱胁迫条件下,转基因植株中DREB2A、P5CS1、RD29A、RAB18和ABI1基因的表达量相对于野生型植株中的表达量提高更为显著;在高盐处理条件下,转基因植株中SOS1和SOS2基因的表达量也较野生型植株中的表达量明显提高。这些抗逆相关基因的上调表达可能是转基因植株抗逆性提高的主要分子机制。     

利用花青素可视化跟踪表达系统快速筛选表达Cry1Ab/c基因的转基因玉米

以草甘膦抗性基因Epsps为标记基因, 在原核Kan^r基因两侧引入Cre(环化重组酶)基因识别的Lox-P位点, 同时以编码花青素合成转录因子的Bi和Cl基因为可视化选择报告基因, 构建了Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/c的可视化跟踪表达载体pBAC9017。用PDS1000/He基因枪转化玉米(Zea mays)自交系501的幼胚和胚性愈伤组织, 获得147个草甘膦抗性的玉米再生植株。其中106棵植株获得了结实种子, 16棵植株的结实种子有紫红色花青素基因的表达。经PCR检测表明, 外源Cry1Ab/c基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株种子蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条和ELISA检测, 结果表明, Cry1Ab/c在部分转基因植株后代中表达。     

转cry1Ab基因抗虫水稻的田间试验

采用农杆菌介导的遗传转化技术, 将Bt基因cry1Ab导入三系恢复系明恢63获得了一批抗虫性及农艺性状较好的转基因纯合株系。研究中, 进一步检测了这些纯合株系的拷贝数、Bt蛋白含量、抗虫性及主要农艺性状。结果显示: 5个转基因纯合株系均为单拷贝; 纯合株系T_1Ab-10及其杂种的Bt蛋白含量最高; 人工接虫和自然感虫试验中, T_1Ab-10对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟均表现高度抗性; 喷药试验中, 阳性植株与阴性植株、对照植株的主要农艺性状均没有显著差异。这说明转cry1Ab基因纯合株系T_1Ab-10具商品化潜力, 可作基因聚合材料。     

苏云金芽孢杆菌沉默基因cry2Ab3在大肠杆菌中表达及杀虫活性研究

对苏云金芽孢杆菌C002菌株cry2Ab基因阳性克隆pHT3152Ab进行亚克隆和序列测定,在CenBank注册后经国际Bt杀虫蛋白基因委员会正式命名为cry2Ab3。序列分析表明该基因含有芽孢杆菌特异的RBS序列,但没有功能性启动子,为沉默基因。根据大肠杆菌T7表达载体pET21b克隆位点和cry2Ab3开放阅读框架(ORF)两端序列,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3,高保真PCR扩增获得cry2Ab3完整ORF,经酶切、连接构建了重组表达质粒pET2Ab3。表达质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后,SDSPAGE电泳证实了cry2Ab3的表达。生物测定显示诱导培养物对棉铃虫初孵幼虫和小菜蛾二龄幼虫具有杀虫活性,能明显抑制二化螟二龄幼虫生长,但对甜菜夜蛾和玉米螟没有明显活性。进一步提取Cry2Ab3蛋白,生测结果表明其对棉铃虫LC50为32.55μg/g。     

苏云金芽孢杆菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表达和杀虫活性研究

以我室自行分离的对鳞翅目夜蛾科害虫具有高毒力的Bt菌株B-Pr-88为材料,用PCR-RFLP方法从其质粒DNA文库中筛选到含cry2Ab基因的一个阳性克隆pZF858,序列测定发现,该片段含有cry2Ab全长基因,开放读码框为1902bps,编码由633个氨基酸组成的70.7kD蛋白,氨基酸同源性与已公布的cry2Ab基因同源性均为99.8%,经Bt基因国际命名委员会正式命名为cry2Ab4。根据cry2Ab4基因开放阅读框架(ORF)两端序列,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3,PCR扩增获得cry2Ab4完整ORF,与大肠杆菌表达载体pET-21b连接,构建了重组表达质粒pET-2Ab4,质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳证实该基因表达了60kD的蛋白,生物测定表明,Cry2Ab4对棉铃虫和大豆食心虫具有高毒力,同时对小菜蛾和二化螟有一定的杀虫活性,而对亚洲玉米螟和甜菜夜蛾没有杀虫活性。     

抗虫耐除草剂转基因玉米SW-1目标性状测试及多重PCR检测

以转基因玉米IE034和12-5为亲本,通过杂交复合获得同时含有cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs基因的复合性状转基因玉米SW-1。农艺性状检测证明SW-1同时具有抗虫和耐除草剂的特性。通过引物特异性筛选、退火温度和引物浓度等条件优化,建立了SW-1的多重PCR检测体系。多重PCR检测体系所用的内标基因为zSSIIb,反应体积为30μL,最佳退火温度为62℃,各引物加入量为0.3μL(10μmol/L)。利用此多重PCR检测体系,当产品中SW-1的质量百分比超过0.5%时,目标基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs都能同时被检测出来。研究结果为复合性状转基因玉米SW-1的分子特征检测提供了良好的技术支撑,同时也为含有cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs基因的其他转化体的多重PCR检测提供了科学数据。     

生菜遗传转化体系的建立及转基因研究

以散叶生菜大速生(Lactuca sativavar.capatataL.)为试材,以MS为基本培养基,采用不同激素配比,确定生菜高效诱芽培养基为MS 1.5mg/L6-BA 0.2mg/LIAA;抗生素敏感性试验表明,筛选培养基中适宜的潮霉素选择压为20mg/L,抑菌剂羧苄青霉素的适宜质量浓度为300mg/L;通过根癌农杆菌介导的叶盘法将携带O型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21-O14-A21-HBcAg转入大速生散叶生菜,对部分抗性植株进行PCR和PCR-Southern杂交检测,证实目的基因已经成功整合到生菜基因组中。RT-PCR检测初步表明,O21-O14-A21-HBcAg基因可以在生菜中正常转录表达。     

Efficient selection and regeneration of creeping bentgrass transformants following particle bombardment

We have established an efficient genetic transformation system for creeping bentgrass (Agrostis palustris Huds.) using particle bombardment. The transformation was performed using the plasmid pZO1052 which contains the reporter β-glucuronidase (uidA) gene and the selectable marker hygromycin phosphotransferase (hph) gene. Transformed calli and plants were obtained via particle bombardment followed by selection of transformants on medium containing 200 mg/l of hygromycin. An average of 4.6 resistant colonies per bombardment were obtained. Southern analysis confirmed the integration of foreign genes in 19 of 21 putative transformants, indicating that selection by hygromycin was highly effective. Received: 6 February 1997 / Revision received: 16 April 1997 / Accepted: 9 May 1997     

Establishment of Genetic Transformation System and Transgenic Studies in Lettuce ( Lactuca sativa var. capatata)

In this experiment , the effects of different hormone concentration on shoot regeneration from cotyledon explants are investigated . The results show that MS medium supplied with 1.5 mg/L 6-BA and 0.2 mg/L IAA is the suitable shoot regeneration. The experiment on sensitivity of cotyledon to hygromycin B and carbenicillin shows that the suitable hygromycin concentration for selecting transgenic tissue is 20 mg/L and the carbenicillin concentration is 300 mg/L. Fused gene O₂₁ - O₁₄ - A₂₁ containing both type O and A FMDV is transferred into lettuce mediated by Ti plasmid of Agrobacterium tumafaciens. The results of PCR and PCR-Southern blotting indicated that the O₂₁ - O₁₄ - A₂₁ gene were successfully integrated into the genomes of some transformed lettuce plants. Expression of O₂₁ - O₁₄ - A₂₁gene in vtransformed lettuce plants was proved by RT-PCR analyses .     

潮霉素抗性3T3细胞的建立和鉴定

目的　建立具有潮霉素 (hygromycin)抗性的 3T3细胞系 ,用于转染目的基因 (pTRE Ins human)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因的质粒pHyg导入 3T3细胞中 ,利用潮霉素的药物选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行PCR鉴定。结果　经 5 0 0 μg ml的潮霉素压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性 3T3细胞的形态和生长速度与正常 3T3细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了潮霉素抗性的 3T3细胞 ,为进行目的基因 (pTRE Ins human)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础。     

口蹄疫抗原决定簇融合基因转化生菜及表达

以3-5天苗龄的散叶大速生生菜(Lactuca sativa var. capatata)无菌苗子叶为外植体, 通过根癌农杆菌介导, 将携带O型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21- O14 -A21-HBcAg导入生菜。研究结果表明, 含有20 mg.L-1潮霉素(Hyg)的S2 培养基(MS+1.5 mg.L-1 6-BA+0.2 mg.L-1 IAA+20 mg.L-1 Hyg +300 mg.L-1 Cb)为子叶外植体转化后诱导愈伤和芽再生的最适培养基, 经抗性筛选, 将抗性芽切下于S3 培养基(1/2MS+20 mg.L-1 Hyg)上诱导生根。通过PCR 和outhern杂交分析证明, 基因已经整合到生菜基因组中。RT-PCR检测初步表明, O21-O14 -A21-HBcAg基因可以在生菜中正常转录。     

Thansgenic peanut plants obtained by particle bombardment via somatic embryogenesis regeneration system

INTRODUCTIONArachiS hypogaea L., Peanut or groundnut, isan importal commercial crop worldwide. It provides an excellellt source of protein and other nutrients. Its production and quality can be severelyimpacted under stressful growing conditions such ascdriate factors, pests and diseajses. Genetic engineering provides a prospective way to reduce certainproblems by transferring individual genes for pestresistance or other traits into elite germplasm of acultiVated species. Thansgenic pea…     

Transgenic peanut plants obtained by particle bombardment via somatic embryogenesis regeneration system.

After pre-culture and treatment of osmosis, cotyledons of immature peanut (Arachis hypogaea L.) zygotic embryos were transformed via particle bombardment with a plasmid containing a chimeric hph gene conferring resistance to hygromycin and a chimeric intron-gus gene. Selection for hygromycin resistant calluses and somatic embryos was initiated at 10th d post-bombardment on medium containing 10-25 mg/L hygromycin. Under continuous selection, hygromycin resistant plantlets were regenerated from somatic embryos and were recovered from nearly 1.6% of the bombarded cotyledons. The presence and integration of foreign DNA in regenerated hygromycin resistant plants was confirmed by PCR (polymerase chain reaction) for the intron-gus gene and by Southern hybridization of the hph gene. GUS enzyme activity was detected in leaflets from transgenic plants but not from control, non-transformed plants. The production of transgenic plants are mainly based on a newly improved somatic embryogenesis regeneration system developed by us.     

利用竞争性PCR筛选无标记Xa21转基因水稻

PCR是一种简单、迅速、灵敏的检测方法,但假阳性与假阴性却影响了它在常规应用中的准确性。本研究利用竞争性PCR解决无标记Xa21转基因水稻PCR检测中的假阳性与假阴性问题。标记基因潮霉素基因(Hygromycin phosphotransferase,hpt)的竞争模板是外加的日本晴hpt转基因植株基因组DNA,抗白叶枯病基因Xa21的竞争模板是待测水稻内源的位于第11染色体上的Xa21同源基因序列。利用这一方法对双右边界T-DNA载体转化产生的转基因T1代植株进行分析,可以有效地减少或排除假阳性或假阴性样品,选出真正的转基因阳性植株。与常规PCR相比竞争性PCR提高了无标记Xa21转基因植株筛选的准确性。对获得的无标记Xa21转基因植株进行白叶枯抗病鉴定与潮霉素抗性鉴定证实了该方法的可靠性。     

高粱叶绿体psbD基因在重组质粒pSD_2Ⅱ中的定位及psbD基因的亚克隆

利用pUC19我们构建了高粱叶绿体基因文库,从库中我们筛选到4个含psbD基因的阳性克隆。Southern分析证明重组质粒由pUC19和高梁叶绿体DNA的Pst10片段组成。通过8种限制性内切酶酶切分析和Southern分析测出了重组质粒pSD_2Ⅱ的物理图谱,并确定了高梁psbD基因在重组质粒中的精确位置。通过构建pSAC_2质粒,可以将Pst10片段中非psbD部分去除,使psbD可以直接用EcoRⅠ从pSAC_2上切下,为研究高粱psbD基因的表达和序列分析奠定了基础。