黑麦1R染色体特异性PCR引物的分子证据

根据黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒａｌｅＬ．）与小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｗｕｍＬ．）ｒＲＮＡ基因间隔区序列差异,按Ｋｏｅｂｎｅｒ设计的引物序列,合成了黑麦特异引物ＮＯＲ－Ｒ１。运用该引物对不同植物材料进行ＰＣＲ扩增,观察表明,含有黑麦１Ｒ染色体的植物均扩增出黑麦的特异带,但含有其他黑麦染色体的小麦种质,普通小麦品种及其近缘物种长穗偃麦草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｅｌｏｎｇａｔｕｍ（Ｈｏｓｔ）Ｂｅａｕｖ）     

特异性单引物PCR

建立特异性单引物PCR,并用于筛选基因克隆重组子。根据α－globin的一段序列设计引物,按照设计好的特性单引物PCR扩增条有α－globin的重组质粒PLNSX－aglobin,具体扩增条件如下：（1）97℃5min变性后,94℃30s,70℃2min30s,30个循环,制备单链模板;（2）94℃1min,12℃5min,16℃3min,18℃3min,20℃3min,22℃3min,25℃1min,30℃3min,37℃3min,72℃6min,低温条件下引物3′端4－5个碱基与所扩单链模板退火配对,扩增得到一系列不同起始位点但同一序列末端长短一的核酸片段;（3）以上述所得片段为模版进行如下条件的扩增：94℃30min,70℃2min,70℃2min,72℃2min,每个循环增加1s）,45个循环。结果,特异性单引物PCR能够从pLNSX－αglobin上扩增出特异带,可有效用于筛选基因克隆重组子。     

黑麦1R染色体的显微分离与回收

建立了利用显微操作技术分离植物单个染色体的方法。以黑麦(Secale cereale L.)为材料,以其标准染色体组型图为依据,识别出黑麦含抗病基因的1R染色体。经显微操作,将单条1R染色体放入Ep-pendorf管中。研究表明,用α-溴奈饱和液对细胞进行预处理,可快速鉴别出黑麦1R染色体。采用去壁低渗制片技术,可明显地改善显微分离单染色体的条件。     

小麦背景中黑麦1R染色体的遗传变异

运用细胞遗传学方法鉴定了来源于中国春×Ｍ２７（１Ｒ／１Ｄ代换系）的花粉植株和Ｆ２单株染色体组成。发现７个花粉植株中出现７种染色体组成变异类型,每株呈现一类变异;而２７个Ｆ２单株中,存在１１种染色体组成变异类型,变异频率仅为３７．０％,低于花粉植株。花粉植株群体中,观察到一个能稳定向后代传递的小麦／１Ｒ小片段易位,但Ｆ２群体中未检测到小麦／黑麦易位。表明常规染色体工程结合花药培养是有计划、有目的实现异源染色体小片段向小麦转移的简便、高效、快速途径。     

黑麦1R染色体的微切微克隆研究

显微分离出黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）１Ｒ染色体,用ＣｏｈｅｓｉｖｅａｄａｐｔｅｒｓｓｉｎｇｌｅｐｒｉｍｅｒＰＣＲ（ＣＡＳＰＰＣＲ）方法进行体外扩增,以ＤＩＧ１１ｄＵＴＰ标记扩增产物为探针,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子杂交,结果表明扩增产物来自黑麦１Ｒ染色体。用１／１０体积的连接物转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α,获得１００００多个重组菌落。经酶切分析,克隆子的插入片段为２５０～５００ｂｐ,为进一步筛选１Ｒ染色体的分子标记打下了基础     

黑麦染色体的显微分离与PCR扩增

利用改良的染色体显微分离技术,分离了黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）一个完整细胞的１８条染色体（１４Ａ＋４Ｂ）,用人工合成的寡核苷酸为引物,进行单一引物法（ｓｉｎｇｌｅｕｎｉｑｕｅｐｒｉｍｅｒＰＣＲ,ＳＵＰＰＣＲ）扩增,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明,ＰＣＲ扩增产物与黑麦基因组ＤＮＡ同源。     

黑麦1R染色体微克隆文库的构建与分析

通过玻璃针分离法 ,从黑麦 (SecalecerealeL .)根尖细胞中期分裂相中显微分离出 2条及 5条 1R染色体。经Sau3A接头介导的PCR(LA_PCR)方法对其进行体外扩增 ,得到了 0 .3～ 2 .5kb之间的DNA片段。以DIG标记的探针进行多次Southern杂交 ,证明显微分离出的染色体的体外扩增产物与黑麦基因组DNA同源 ,并且来自 1R染色体。然后利用 5条 1R染色体的第二轮PCR产物构建质粒文库 ,可得到 2 2 0 0 0 0个重组子。随机挑选 172个重组子进行分析 ,发现插入片段主要介于 30 0～ 180 0bp之间。此外 ,根据基因组点杂交结果推算出该文库包含约 42 %的中、高重复序列和 5 8%的单、低拷贝序列 ,而且文库的冗余度较低。研究构建的黑麦 1R染色体微克隆文库为 1R染色体高密度遗传图谱的建立以及位于其上的重要基因的定位与分离提供了便利。     

黑麦6R抗白粉病基因向小麦的渗进与鉴定

为了将黑麦６Ｒ染色体上抗小麦白粉病的基因导入小麦,选用了一个６Ｒ／６Ｄ代换系Ｍ２４为亲本之一,分别与小麦栽培品种和第６部分同源群缺体系杂交,杂种出现６Ｒ或／或６Ａ,６Ｂ,６Ｄ单,双或三单体等各种情况,取其花药进行培养,共获得２４１个再生植株,对其中３２个抗白粉病的花粉植株经染色体计数,Ｃ－分带,基因组原位杂交,同工酶等电聚焦电泳和或／ＲＦＬＰ分子标记检测,发现有６株仍保持为６Ｒ／６Ｄ代换系,有１０     

一个1B/1R小麦-黑麦染色体易位的鉴定

本研究对冬小麦品系73(36)9-1的1B/1R易位染色体进行了遗传分析。发现73(36)9-1有一对随体染色体,它的两个亲本矮丰四号及洛夫林10(Lovrin lo)分别有两对和一对随体染色体。观察用矮丰四号回交的F_1,绝大部分花粉母细胞的中期染色体都能正常配对,而用洛夫林10回交的,除了多数产生两个单价体之外,正常配对的情况也能经常看到。同时还发现,73(36)9-1和“中国春”双端体(CSDT)的1BL能很好地配对并形成一个棒状的异形二价体,而它和CSDT 1BS的染色体则主要产生20″+1′+t′的构型,从而证明易位发生在1B染色体的短臂,并且该易位的片段来自黑麦染色体1RL。本文还讨论了该易位发生的可能途径,推断是由于在F_1花粉母细胞中的两个单价体(一个是小麦染色体1B,一个是黑麦染色体1R)同时进行错分裂之后产生的两种端着丝点染色体(1BL和1RL)重新并合形成的,因而冬小麦73(36)9-1可能是一个自发产生的易位系。     

基于特定引物PCR的DNA分子标记技术研究进展

SSR、SCAR、SRAP和TRAP是4种最新发展的基于特定引物PCR的新型DNA分子标记技术,具有简便、高效、重复性好等优点,已在遗传育种和种质资源研究等各个方面得到广泛应用。介绍了这4种分子标记的基本原理和特点,综述了它们在分子生物学研究中的应用。     

一个小麦/黑麦小片段染色体易位系的创制和鉴定

从来源于组合中国春×M27(1R/1D代换系)的8个花粉植株中,分离获得1个小麦/黑麦小片段染色体易位系WER-1-2。C-分带和荧光原位杂交结果显示,衍生出易位系WER-1-2的原始麦穗含有1条完整的1R染色体和1条长臂端部发生缺失的1R染色体,所缺失部分易位到1条小麦染色体上。推断该易位是在花药离体培养过程中经异常有丝分裂产生的,而非异常减数分裂的产物。表明花药培养是一条实现异源染色体小片段(基因)向小麦转移的快速而有效的途径。     

人14p＋标记染色体的分子细胞遗传学研究

一例23岁女性患者因近五、六年来出现胡须、四肢多毛及偶有月经不规则而就诊。细胞遗传学检查发现一个短臂明显增大的亚中着丝粒的14号标记染色体14p ·p 区域GTG显带呈浅染,C-带暗染,都呈均匀的染色区。硝酸银染色在p 远侧端显现一个Ag-NOR,其大小与正常近端着丝粒染色体的无明显差异。应用~3H标记的7.3 kb长的rRNA基因探针进行染色体原位杂交,自显影银颗粒沿整个p 区域分布,p 上的银颗粒数是正常近端着丝粒染色体短臂上银颗粒平均数的5倍。这些结果排除了Y或其他染色体参加的重排形成p 的可能性,并表明Ag-NOR的大小或NOR的数目并不一定与rRNA基因的数量成正比。研究Dp 或Gp 类型的染色体变异,对了解人二倍体细胞内rRNA基因表达的调控有重要意义。     

单引物预掺入PCR与抗体可变区基因的体外放大

用针对引导序列的5′-引物和针对恒定区的3′-引物,常规PCR程序只使所选5株单抗10个可变区cDNA中的4个得到放大.新设计的程序增设了一个反应时相:94℃ 1 min,37℃ 6-8min,循环1-3次,只加入5′-引物,补充3′-引物后,转入常规PCR循环,10个可变区cDNA均获放大.此程序被命名为“单引物预掺入PCR”.     

Specificity and performance of PCR detection assays for microbial pathogens

PCR has become a widely used tool for detection, identification and differentiation of pathogenic microorganisms in diagnosis of animal and human diseases. However, quite a number of currently used protocols can be further optimized to exclude nonspecific reactions. On the one hand, target sequences as defined by primer binding sites should be checked carefully for the absence of significant homologies to other organisms in order to insure high specificity of detection. A major part of PCR assays is still based on target sequences in the ribosomal RNA operon, but, as the differentiating potential of this region is limited, genes encoding cellular proteins, such as toxins, surface antigens or enzymes, have been shown to be a viable alternative in many instances. On the other hand, various approaches are available to improve the performance of the amplification reaction itself. The kinetics of amplification is known to be heavily dependent on primer-to-template ratio, efficiency of primer annealing and enzyme-to-template ratio. In the present paper, recently published PCR detection assays for microorganisms, particularly bacterial pathogens, are reviewed and optimization strategies are explained. The practical implications and epidemiological consequences of routine use of PCR in the diagnostic laboratory are also discussed.     

Design and Development of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detection of HIV-1 and HCV Using Molecular Beacons

At least 10 million individuals worldwide are co-infected with immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV). These two viruses are transmitted most primarily by exposure to infected blood or blood products. Various nucleic acid assays have been developed for diagnostics and therapeutic monitoring of infections. In the present study, a multiplex real-time PCR assay for simultaneous detection of HCV and HIV-1 using molecular beacons were designed and validated. A well-conserved region in the HIV-1 pol gene and 5′NCR of HCV genome were used for primers and molecular beacon design. The analysis of scalar concentrations of the samples indicated that this multiplex procedure detects at least 1,000 copies/ml of HIV-1 and 100 copies/ml of HCV with linear reference curve (R ² > 0.94). The results demonstrate that a specificity of 100 % and sensitivity of 96 % can be achieved. The analytical sensitivity study with BLAST software demonstrated that the primers do not attach to any other sequences except for that of HIV-1 or HCV. The primers and molecular beacon probes only detected HIV-1 and all major variants of HCV. This assay may represent an alternative rapid and relatively inexpensive screening method for detection of HIV-1/HCV co-infection especially in blood screening.