水稻Argonaute 2蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了制备水稻Argonaute 2(AGO2)的多克隆抗体,该研究采用RT-PCR扩增OsAGO2蛋白165~401aa片段和440~570aa片段的编码序列,并构建了2个原核表达载体。诱导表达重组蛋白后注射家兔,制备了相应的多克隆抗体,最后利用Western blot初步分析水稻AGO2蛋白的表达模式。结果表明:成功构建2个表达载体,通过诱导获得了分子量约为30kD和23kD的重组蛋白。其中,以440~570aa片段为抗原所制备的多克隆抗体免疫印记效果较好。Western blot表明在水稻花药、愈伤组织及小穗中检测到OsAGO2表达。该研究为进一步深入探讨水稻OsAGO2基因的特性与功能奠定了基础。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

水稻Os着-c op 1基因的原核表达及多克隆抗体制备

着-COP蛋白是真核生物分泌途径中COP玉有被小泡的一个亚基。本研究利用PCR技术扩增水稻着-c op基因(Os着-c op 1)的ORF(开放阅读框),并克隆到原核表达载体pET-23d上,将表达载体pET-Os着-cop1转入大肠杆菌BL21(DE3),以1.0 mmol/L的IPTG (isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导表达重组蛋白,然后以重组蛋白作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE电泳分析结果表明,成功诱导表达了分子量约为35 kD的重组蛋白,Western blot检测表明,免疫家兔的抗血清与水稻幼穗总蛋白杂交信号较好。Os着-COP1抗体的制备有助于研究该基因及COPI小泡在水稻中的功能。     

人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的:通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体。方法:将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3);加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度、诱导剂IPTG终浓度、诱导时间等条件进行优化;利用12%SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA、Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性。结果:构建了pET30a(+)-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0. 2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1. 35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核。结论:利用重组人Nek2蛋白获得具有良好抗原特异性的抗Nek2多克隆抗体。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的构建及其生物学特性初步探讨

以伪狂犬病毒基因缺失标志疫苗株TK/gG-/LacZ 为亲本株,通过同源重组,构建了表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病毒TK/gG-/GP5 .经PCR、Southern杂交、Western blot证实构建正确,并能表达GP5.同时,对重组病毒在PK-15细胞中的增殖特性进行了检测,结果与亲本株相比,增殖滴度无显著性差异.将重组病毒免疫BALB/c小鼠,2次免疫后4周,50%(3/6)小鼠产生了低水平的GP5特异性ELISA抗体,但中和抗体均小于1:4.     

人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备 *

目的通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体.方法 将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21 (DE3);加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度,诱导剂IPTG终浓度,诱导时间等条件进行优化;利用12% SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA,Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性.结果 构建了pET30a(+)-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0.2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1.35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核.结论: 利用重组人Nek2蛋白获得具有良好抗原特异性的抗Nek2多克隆抗体.     

GOLPH2的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用

目前发现GOLPH2蛋白与肝癌密切相关,将golph2基因进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增得到golph2 cDNA,将其克隆到原核表达载体pET21a(+)-TRX内、转化大肠杆菌DH5a,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白GOLPH2,SDS-PAGE鉴定.将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中GOLPH2蛋白水平.成功地构建了表达TRX-GOLPH2融合蛋白的原核表达质粒pET21a(+)-TRX-GOLPH2.并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以可溶性的形式存在.SDS-PAGE和Western blot证实,重组GOLPH2蛋白质与预期结果一致.抗血清能够特异地识别52 kD重组蛋白、73 kD细胞裂解液和血清蛋白质.成功制备了GOLPH2蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究.     

PTD融和蛋白的原核表达及其抗体制备

目的:为制备凋亡素重组蛋白抗体,首先获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,而且通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体,为进一步利用凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的检测奠定基础.方法:应用重叠延伸的基因融合技术将LHRH(黄体生成激素释放激素)基因、TAT(HIV-1反式转录激活因子)基因和凋亡素基因重组,构建成凋亡素重组蛋白原核表达载体pET-28a-LTA,随后将表达质粒转入BL21菌株,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,将已表达的重组蛋白通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化,并制备LTA凋亡素重组蛋白抗体.结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,LTA蛋白融合基因获得高效表达,凝胶薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白12.6%.LTA蛋白经Ni-NTA亲和色谱柱柱纯化,以纯化蛋白为抗原免疫獭兔制备凋亡素重组蛋白抗血清.结果表明抗体的效价为1: 12800.结论:应用重叠延伸的基因融合技术获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体.     

水稻Qb-SNARE蛋白OsNPSN11多克隆抗体制备、鉴定与应用

在真核生物细胞囊泡运输过程中的膜融合主要是由SNARE蛋白介导的, OsNPSN11是从水稻中克隆的Qb-SNARE家族基因, 文章将OsNPSN11构建到原核表达载体pET-30a中与6个His标签融合, 重组质粒pET-OsNPSN11转化BL21(DE3)0.5 mmol/L IPTG诱导4 h后获得了高效表达。用镍离子亲和树脂(Ni²⁺-NTA His Bind Resin) 纯化融合蛋白, 以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰家兔制备多克隆抗体, Western blotting结果显示, 该抗体能特异识别在原核系统表达的抗原, 以及水稻不同组织质膜组分中的OsNPSN11, 可用于转基因水稻中目标蛋白的表达分析。     

重组抗狂犬病病毒抗体在HEK293 EBNA1细胞中的瞬时表达优化

目的:优化重组抗体在悬浮无血清培养的HEK293 EBNA1瞬时表达,提高重组抗体表达量。方法:将HEK293 EBNA1细胞适应于无血清悬浮培养,筛选适宜的无血清培养基。使用PEI转染质粒进入细胞,瞬时表达重组抗体;使用Modde软件进行实验设计(DOE),优化转染质粒量、轻重链比例、PEI量等影响瞬时表达的条件。培养上清经亲和纯化,获得目标抗体,用快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)测定抗体活性,用BCA法测定纯化抗体浓度。结果:293SFMII为适宜的HEK293 EBNA1细胞无血清悬浮培养基。对抗体表达影响最大的因素是轻重链比例(P=0.00000),其次为质粒浓度(P=0.00086),最后为PEI(P=0.00257)。优化的转染条件为:质粒用量0.61μg/106细胞,轻重链比例2:1,PEI 2.67μg/106细胞,优化后抗体表达量有显著提高(P=0.007)。结论:通过DOE优化获得了重组抗狂犬病病毒抗体的高水平表达,抗体表达量提高了至少50倍。