小型核酶的结构和催化机理

自然界存在的小型核酶主要有锤头型核酶、发夹型核酶、肝炎δ病毒（HDV）核酶和VS核酶.锤头型核酶由3个短螺旋和1个广义保守的连接序列组成;发夹型核酶的催化中心由两个肩并肩挨着的区域构成;HDV核酶折叠成包含五个螺旋臂（P1～P4）的双结结构;VS核酶由五个螺旋结构组成,这些螺旋结构通过两个连接域连接起来.小型核酶的催化机理与其分子结构密切相关.金属离子或特定碱基都可作为催化反应的关键成分.锤头型核酶的催化必须有金属离子（尤其是二价金属离子）参与,而发夹型核酶则完全不需要金属离子.基因组HDV核酶进行催化时要有金属离子和特定碱基互相配合.     

发夹核酶的研究与应用

核酶 (ｒｉｂｏｚｙｍｅ)是既能特异识别又能特异切割小分子ＲＮＡ的核酸内切酶 ,其本身也是ＲＮＡ ,主要包括发夹核酶、锤头核酶、丁肝病毒、链孢霉属ＶＳ和铅依赖性ＲＮＡ ,共同特点是可逆地切割底物ＲＮＡ的磷酸二酯键 ,生成 5′ ＯＨ和 2′ ,3′ 环磷酸末端。虽然催化产物相似 ,但它们的结构和催化机制却是很不相同的。发夹核酶 (ｈａｉｒｐｉｎｒｉｂｏｚｙｍｅ)发现于三种不同植物ＲＮＡ病毒 ,即烟草环点病毒 (ｔｏｂａｃ ｃｏｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ) ,菊苣黄色斑点病毒型 (ｃｈｉｃｏ ｒｙｙｅｌｌｏｗｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓｔ…     

生物的核酶及其功能

核酶是有催化功能的RNA,目前发现的核酶可分为两大类（大分子核酶,小分子核酶）,共7种（大分子核酶包括第一类内元,RNase的RNA组分;小分子核酶包括锤头型,发夹型,肝炎δ病毒核酶,VS核酶）。本文概括了这些核酶的功能及其在理论和实际（主要是医学）方面的应用情况。     

LncRNA MIR4435-2HG靶向TGF-β1对NSCLC细胞的影响

[目的]探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG(LncRNA MIR4435-2HG)靶向上调转化生长因子-β1(TGF-β1)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞迁移、增殖的作用及其初步机制。[方法]检测NSCLC癌组织及其癌旁组织、NSCLC细胞株及正常人支气管上皮细胞(HBE)中MIR4435-2HG和TGF-β1表达。将pcDNA-MIR4435-2HG和pcDNA质粒转染至A549细胞,CCK-8法、Transwell法检测细胞增殖、迁移能力。Western Blot法检测细胞TGF-β1表达。免疫共沉淀验证MIR4435-2HG与TGF-β1靶向作用。[结果]NSCLC组织MIR4435-2HG(1.89±0.52 vs 0.76±0.48)和TGF-β1相对表达量(1.43±0.22 vs 0.37±0.18)均高于癌旁组织(P<0.05);与HBE细胞比较,NSCLC细胞株MIR4435-2HG相对表达量升高(P<0.05),且其中A549细胞高于H226细胞(P<0.05);与阴性对照组比较,MIR4435-2HG过表达组细胞MIR4435-2HG...     

玉米核基质结合区在烟草中对外源转基因表达水平的影响

为研究核基质结合区(matrix attachment region, MAR)在转基因植物中的功能,将来自玉米基因组的MAR序列构建在植物表达载体T-DNA中, 并将报告基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(uidA)插入两段MARs序列之间.将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体分别转化烟草(Nicotiana tabacum L.).GUS活性检测表明,MARs可以显著提高外源基因uidA在转基因烟草中的表达水平,平均表达水平提高2倍,最高单株活性可达10倍.并且转基因植株GUS活性高低与稳定mRNA的量成正比,表明MARs在转录水平提高基因表达.     

抗肿瘤细胞多药抗性基因MDR1和MRP1双靶位自剪切核酶的合成及其在体外活性研究

多药耐药基因MDR1和 (或 )MRP1过度表达是引起肿瘤细胞对化疗药物产生多重耐药性的重要原因 .在以往研究抗MDR1基因的核酶 (196MDR1 Rz)的基础上 ,合成了针对MRP1基因 2 10和 730编码子的核酶 (2 10MRP1 Rz ,730MRP1 Rz) ,同时利用RNA二级结构分析程序mfold 3 0设计合成了一种双靶位自剪切核酶体系 (Coat) .将 196MDR1 Rz和 2 10MRP1 Rz基因同时载入到该体系中 ,建立了抗MDR1 MRP1双靶位核酶 .在无细胞体系中对上述核酶进行的生物活性实验表明 ,2 10MRP1 Rz与 730MRP1 Rz相比能够更有效地切割底物 ;载入Coat的抗MDR1和MRP1核酶均能得以有效释放 ,同时切割各自的靶RNA序列 ,切割效率与单靶位核酶一致 ;串联核酶的先后顺序不影响切割活性     

“发夹”催化型RNA抑制HIV-1表达

北伊利诺伊斯大学(NIU)和加州大学圣迭戈校区(UCSD)的科学家发现,一种“发夹”状催化型 RNA 在人组织培养实验中能抑制 HIV-I 表达。NIU 的 Arnold Hampel 博士及其同事,以及 UCSD 的Flossie Wong-Staal 博士,发现这种发夹状核酶(ribozyme)能切割 RNA 基因拷贝,从而使 HIV-I     

抗人组织金属蛋白酶抑制剂—1核酶的体外制备和活性鉴定

研究了特异切割人瘢痕组织中组织金属蛋白酶抑制剂 1(tissueinhibitorofmetalloproteinases 1,TIMP 1)的锤头状核酶 ,测定了其体外切割活性。制备特异切割TIMP 1的U6snRNA嵌合型核酶基因克隆。TIMP 1mRNA基因片段克隆至T载体。用体外转录法大量制备以 [α 3 2 P]UTP标记的核酶及靶RNA ,进行体外切割实验。结果表明 :核酶∶底物 =1∶1时 ,活性的U6snRNA嵌合型核酶 (U6Rz35 8)在 5 0℃具有最佳切割活性 ,切割效率为 76 .34% ;37℃时 ,切割效率为 5 5 .2 1%。5 0℃时 ,Km=39.6nmol/L ,kcat=0 .2 1min-1;而点突变型核酶U6Rz35 8m 没有切割活性。制备的U6 Rz35 8有良好的特异切割活性 ,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人TIMP 1的表达。     

桑花叶萎缩类病毒基因组结构特征及聚类分析

桑花叶萎缩类病毒(Mulberry mosaic dwarf viroid, MMDVd)是近些年发现的桑花叶型萎缩病的病原物,本研究利用Mfold等软件和保守序列分析了MMDVd的二级结构及其中存在的核酶,并进一步对类病毒和卫星RNA进行了聚类分析,以期解决其分类和进化地位。结果表明MMDVd的正链存在典型的锤头型核酶结构,自切割位点为AUC,负链存在有疑似发夹型核酶的二级结构,是目前发现的第四个发夹核酶。聚类分析研究中,Pospiviroidae科类病毒单独形成一分支,Avsunviroidae科PLMVd和CChMVd首先与v LTSV聚合,而本研究MMDVd首先与卫星RNA s TRSV、s ArMV聚合,结合MMDVd正负链不同于已知Avsunviroidae科的两个锤头型核酶的结构,表明MMDVd应为一个新的未分类属,对于其核酶的自切割活性及其复制机制,则需要进一步的实验研究来验证。     

特异切割苹果锈果类病毒的核酶基因的克隆和转录物的体外活性测定

根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成和克隆了特异切割苹果锈果类病毒ASSVd正链 (194-196位点 )或负链 (89- 91位点 )RNA的 2个短臂锤头型核酶基因 :42nt的RzASSVd(+)和 40nt的RzASSVd(- )。经转录获得核酶转录物和³²P标记的ASSVd正、负链转录物。将核酶与ASSVd混合 ,50℃或 37℃保温 3～ 4h ,进行 8%PAGE(含8mol L尿素 )和放射自显影分析。体外切割检测表明 :2个核酶均具有特异切割活性 ,其中RzASSVd(- )对ASSVd负链的切割活性较高 ,对ASSVd正链不起作用。RzASSVd(+)对ASSVd正链的切割活性较弱 ,对ASSVd负链亦不起作用。在此基础上 ,构建得到双价核酶基因pGEMRzASSVd(± )。     

烟草花粉发育过程及不同组织中的内源GUS活性

以 X- gluc作为葡糖苷酸酶 ( GUS)酶反应底物 ,用酶组织化学方法检测了烟草 ( Nicotianatabacum L.)不同组织细胞的内源 GUS。在幼苗的根、茎、叶不同发育时期的花药壁、柱头、胚珠分离的生殖细胞和胚囊中 ,均未检测到内源 GUS活性。不同发育时期的烟草花粉内源GUS活性存在差异 ,在小孢子分裂前后和成熟花粉萌发前后有两个活性高峰。检测花粉内源GUS活性的适宜 p H为 5 .0 ;p H7.0的条件下未检测到内源 GUS。用 2 0 %甲醇或 0 .2mmol/L葡糖二酸内酯处理不能完全抑制内源 GUS活性     

桑花叶萎缩类病毒基因组核酶活性及其对桑树侵染性的研究

桑花叶萎缩类病毒（Mulberry mosaic dwarf viroid,MMDVd）基因组由单链环状小分子RNA组成,根据预测二级结构可能存在锤头核酶（Hammerhead ribozyme,HH）和疑似发夹核酶（Hairpin ribozyme,HP）,但目前还缺乏对核酶活性的研究。本研究使用体外自切割和2,3-环磷酸基测序对核酶活性及自切割位点进行了鉴定,并在发夹核酶Loop1增加一对碱基设计合成了突变核酶MMDVd-HP’,比较了其与MMDVd-HP的活性差异,分析了MMDVd对正常未染病和桑花叶卷叶病相关病毒（Mulberry mosaic leaf roll-associated virus,MMLRaV）阳性桑树的侵染。体外自切割结果显示,所有核酶均成功自切割产生了相应的单体,均有核酶活性。2,3-环磷酸基测序结果显示,腺苷化接头分别连接于第7位的C和302位的A之后,MMDVd-HH的切割位点位于AUC↑处,MMDVd-HP切割位点位于ACA↓处。定量PCR结果显示反应体系中的MMDVd-HP多于MMDVd-HP’,表明MMDVd-HP’更多的发生了切割,活性高于MM...     

阿柏西普减轻高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤和PI3K/AKT信号通路活化

目的 探究阿柏西普(aflibercept,ABC)对高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的影响及可能机制.方法 取人视网膜色素上皮细胞APRE-19,并随机分为对照组、高糖组(HG)和HG+ABC组.其中对照组细胞常规培养,HG组细胞用30mmol/L葡萄糖培养液培养,HG+ABC组细胞用30mmol/L葡萄糖和2mg/...     

应用扫描隧道显微镜技术观察针对HBsAg基因转录物的核酶的二级结构

核酶(Ribozyme)是具有催化RNA切割反应功能的RNA,它可以特异性地切割RN-A。最近,核酶的一级结构已经被证实,其与底物结合时所形成的二级结构如锤头状(Hammerhead)、发夹型(Hairpin)结构,亦得到初步证实。因此,能够设计并人工合成核酶,通过特异性破坏RNA,阻断其功能,从而有效地阻止病毒的复制和繁殖。这是近年来继反义RNA之后发现的又一个抑制基因表达的有力工具,开辟了分子生物学的一个新领域。     

10-23脱氧核酶介导的生物传感器研究进展

近20年间,DNA介导的生物传感器得到了快速的发展,DNA能够作为遗传信息重要载体的同时,其折叠成的空间构象也具有很多的功能。功能核酸的概念逐渐引入到了包括生物传感、生物成像、医疗在内的重要领域中。10-23脱氧核酶作为功能核酸的一种,是通过体外筛选技术得到的,Mg2+存在的条件下能够特异性识别并切割RNA,切割位点为RNA中的嘧啶与嘌呤间的磷酸二酯键。由于其独特的识别以及切割能力,10-23脱氧核酶介导的相关疾病治疗得到了广泛的应用,同时人们逐渐开始关注10-23脱氧核酶介导的生物传感器的搭建。本文对于10-23脱氧核酶的结构、性质、作用方式以及改进修饰进行了介绍,并对10-23脱氧核酶介导的生物传感器的搭建以及应用进行了综述,为人们在未来使用10-23脱氧核酶搭建新型快捷生物传感器奠定理论基础。     

10-23脱氧核酶介导的生物传感器研究进展

近20年间,DNA介导的生物传感器得到了快速的发展,DNA能够作为遗传信息重要载体的同时,其折叠成的空间构象也具有很多的功能。功能核酸的概念逐渐引入到了包括生物传感、生物成像、医疗在内的重要领域中。10-23脱氧核酶作为功能核酸的一种,是通过体外筛选技术得到的,Mg²⁺存在的条件下能够特异性识别并切割RNA,切割位点为RNA中的嘧啶与嘌呤间的磷酸二酯键。由于其独特的识别以及切割能力,10-23脱氧核酶介导的相关疾病治疗得到了广泛的应用,同时人们逐渐开始关注10-23脱氧核酶介导的生物传感器的搭建。对于10-23脱氧核酶的结构、性质、作用方式及改进修饰进行了介绍,并对10-23脱氧核酶介导的生物传感器的搭建及应用进行了综述,旨为人们在未来使用10-23脱氧核酶搭建新型快捷生物传感器奠定理论基础。     

动物遗传工程

961945 作为药理学工具的转基因动物[英]/Buerki,K.…//Adv.Drug Res.-1995,26.-143～177[译自DBA,1995,14(24),95-14457] 综述内容如下:(1)产生遗传改良动物的方法;(2)获得功能模型,如点突变或克隆序列的定向插入,cre/lox-介导的基因或转基因的活化;(3)丧失功能模式,如反义RNA、核酶或显性阴性突变的表达、