线粒体DNA高变区hv1快速测序方法及应用

本研究目的是使线粒体DNA hv1区的测序更加简单、快速和准确,以利于法医学检案。将线粒体DNA hv1高变区分别用三对重叠的引物进行全序列扩增,对这三对引物的扩增产物进行测序分析。用经过大量实验反复摸索得到的稳定的实验条件．对已确定为同一母亲所生的兄弟二人的样品进行分析,结果完全一样;对待确定姐弟关系的样品进行分析,结果是认定的;操作时间较原方法缩短一半。结果表明该方法是可替代原法的快速测序法。     

线粒体基因组测序策略和方法

本文综述了线粒体基因组测序策略和方法,在传统测序方法中介绍了基于物理分离线粒体DNA的克隆文库测序方法和基于PCR扩增产物的直接测序方法,后者重点介绍了基于长PCR扩增产物的引物步移法和基于总DNA的引物步移法;应用新一代高通量测序方法有基于总DNA样品的方法,包括需要预扩增mtDNA的多物种平行高通量和无需预扩增mtDNA的高通量方法,基于总RNA样品的转录组测序方法等。在实际工作中,选择哪种方法取决于研究规模、样品大小和保存状态、经费情况等。总的来说,基于长PCR扩增产物的引物步移法尤其适合小规模昆虫线粒体基因组研究,而对于大规模线粒体基因组研究来说,NGS技术无疑是省时省力的最佳选择。     

穿山甲标本和甲片的DNA提取及PCR扩增

为验证经处理后的穿山甲(Manis spp.)标本和甲片是否可以用于种间分子鉴定标记的开发及个体识别工作,本文在样品的预处理、消化、提取后纯化等方面对传统提取方法进行了改进,分别从穿山甲剥制标本、干皮标本及甲片中提取总DNA;然后用Cyt b基因扩增通用引物、12S rRNA基因全序列扩增引物、RAPD引物及微卫星引物进行了PCR扩增,并对部分扩增结果进行了序列测定.结果表明,除剥制标本的脚底皮张组织外,其他样品基本都可以提取出DNA.以此为模板的PCR扩增中,2种线粒体基因引物扩增出明显目的条带,RAPD引物扩增出种间特异条带,测序结果可用于种间特异性引物及SCAR引物的开发;微卫星引物在甲片样品中扩增稳定,可用于个体识别工作.     

鸻形目鸟类线粒体基因组测序策略

鸻形目（Charadriiformes）,全世界约有384个物种,分属于19科94属,种类繁多、分布广泛,是研究迁徙和觅食行为的良好材料。近年来,线粒体基因组的研究快速发展,由于样品难以收集,缺乏系统的测序策略,鸻形目鸟类线粒体基因组的研究相对滞后。引物设计对聚合酶链式反应（PCR）至关重要,一个成功的PCR实验依赖于高质量的特异性引物,本研究拟设计一套用于鸻形目鸟类线粒体基因组扩增的通用引物。对GenBank中现有的鸻形目物种线粒体基因组进行多重比对,发现若干个保守性区域,本研究在该区域设计13对扩增鸻形目鸟类线粒体基因组的通用引物,扩增的目的片段长度均在1.5 kb左右。我们选取4个物种,即灰头麦鸡（Vanellus cinereus）、丘鹬（Scolopax rusticola）、白腰草鹬（Tringa ochropus）和针尾沙锥（Gallinago stenura）,进行PCR扩增验证,设计的引物在4个物种中均能顺利扩增、测序,该引物在鸻形目鸟类线粒体基因组扩增中的具有普遍适用性。本研究设计的13对通用引物在扩增鸻形目物种线粒体全基因组中具有较强的应用价值,将为鸻形目的系统发育关系、种群遗传学和生物地理学研究提供珍贵的资源。     

通用引物双重PCR在节肢动物物种鉴定中的应用

【目的】本研究旨在使用基于线粒体基因通用引物的双重PCR技术同时扩增单一样本中两条标记基因,从而达到简化节肢动物物种鉴定流程的目的。【方法】在一次PCR实验中同时加入可扩增线粒体COI基因和16S rDNA两个不同分子标记的引物,对3纲8目14科的14种节肢动物物种标本的基因组DNA进行扩增;扩增产物经电泳和胶回收后测序,并BLAST在线搜索相似序列,验证基于通用引物的双重PCR在不同的动物类群中用于物种鉴定的有效性。【结果】应用基于COI和16S rDNA的引物从分属于3纲8目14科的14种节肢动物基因组DNA中均可成功扩增目的基因;扩增产物测序结果进一步证实了扩增的准确性。【结论】通过本方法进行物种的分子鉴定,不仅可以保证物种鉴定的高准确率,还可以明显减少时间与DNA样本量的消耗,这对需要快速准确鉴定物种或珍稀的材料样本十分重要。     

进口肉骨粉中牛成分检测研究

根据18S核糖体基因保守序列设计引物,对牛骨粉,鱼粉,牛肉,羊肉,猪肉,鸡肉,鸭肉,鱼肉的DNA样品进行PCR扩增,均得到137bp的扩增片段;根据牛线粒体的特异基因片段设计引物,对上述材料DNA样品进行PCR扩增,结果只在牛肉和牛骨粉中出现271bp的扩增,本实验建立了从进口肉骨粉中检测牛成分的PCR方法,检测灵敏度达到牛成分含量为0．1％（W／W）的水平,用建立起来的方法对进口肉骨粉,鱼粉和饲料添加剂进行了检测,结果在5批肉骨粉中检测出含有可能导致疯牛病的牛成分。     

中国人常见HLA—DPB1不明确杂合子SSP分型解决方案

目的：人类染色体是二倍体,这使得以测序方法研究多态性区域时会遇到不明确杂合子,这个问题在HLA-DPB1的分型上尤为突出。试图寻找一个来解决HLA-DPB1分型中不明确杂合子比例高给分型带来的困难的方案。方法：对946例样品进行HLA-DPB1分型,其中不明确杂合子有353例,共30种,占总例数的37％。建立了一套SSP分型方法,设计上游引物6条,下游引物15条,每一个样品同时用两对特异性引物进行扩增,两对引物分别代表两种不同的杂合模式。再从30种不明确杂合子类型中各挑2个样品进行克隆测序,结果与SSP分型结果比较。结果：SSP分型方法采用同一套扩增体系与两套循环反应条件,只需一次PCR扩增,就可以方便快捷地实现不明确杂合子的分辨,其结果与克隆测序结果相符。结论：与以往的克隆测序、SSCP方法相比,本研究中SSP分型方法具有高效率、高通量、省时省力的特点。     

中国人常见HLA-DPB1不明确杂合子SSP分型解决方案

目的:人类染色体是二倍体,这使得以测序方法研究多态性区域时会遇到不明确杂合子,这个问题在HLA-DPB1的分型上尤为突出。试图寻找一个来解决HLA-DPB1分型中不明确杂合子比例高给分型带来的困难的方案。方法:对946例样品进行HLA-DPB1分型,其中不明确杂合子有353例,共30种,占总例数的37%。建立了一套SSP分型方法,设计上游引物6条,下游引物15条,每一个样品同时用两对特异性引物进行扩增,两对引物分别代表两种不同的杂合模式。再从30种不明确杂合子类型中各挑2个样品进行克隆测序,结果与SSP分型结果比较。结果:SSP分型方法采用同一套扩增体系与两套循环反应条件,只需一次PCR扩增,就可以方便快捷地实现不明确杂合子的分辨,其结果与克隆测序结果相符。结论:与以往的克隆测序、SSCP方法相比,本研究中SSP分型方法具有高效率、高通量、省时省力的特点。     

双歧杆菌属特异性测序引物筛选及优化

【背景】目前双歧杆菌的益生功能被普遍认可,越来越多的研究开始关注肠道中双歧杆菌的生物多样性。然而双歧杆菌是肠道中的低丰度物种,现有技术尚难以深入研究其多样性。【目的】基于双歧杆菌16SrRNA基因序列筛选一对适用于分析粪便样品中低丰度双歧杆菌属多样性的特异性引物。【方法】依据已有引物的相对位置及其与双歧杆菌属16S rRNA基因序列的匹配率,将引物重组优化得到扩增片段800 bp的双歧杆菌属特异性引物;通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行实验筛选和特异性验证;以细菌通用引物(27f/1492r)为参照,通过单分子实时(Single-molecule real-time,SMRT)测序技术对不同引物的3份粪便样品中细菌的DNA扩增子进行测序,在种水平上分析比较不同引物的优劣。【结果】对文献中已有的9对双歧杆菌特异性引物进行重组并优化,其中2对引物的理论特异性较好且扩增产物大于800 bp,它们分别为Bif164-f/Pbi R2和Pbi F1/Pbi R2。PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验发现,Bif164-f/Pbi R2的扩增条带明亮且无拖尾。此外,利用SMRT测序平台对引物27f/1492r和Bif164-f/Pbi R2的3份粪便样品中细菌的DNA扩增子进行测序并分析。27f/1492r扩增子的分析结果显示,3份样品依次分别含1、3、4个双歧杆菌种且双歧杆菌的平均相对含量为0.34%;而Bif164-f/Pbi R2扩增子的分析结果显示,3份样品依次分别含2、6和8个双歧杆菌种且双歧杆菌的平均相对含量为98.72%。上述结果表明,Bif164-f/Pbi R2可在种水平上特异地检出粪便中低丰度的双歧杆菌,进而实现样品中双歧杆菌的多样性分析。【结论】筛选出一对双歧杆菌特异性引物Bif164-f/PbiR2,可在种水平上分析粪便样品中低丰度双歧杆菌的生物多样性,同时也验证了理论结合实验进行引物筛选这种方法的可行性。     

复合PCR扩增人mtDNA HVR方法的初探

目的:建立一种高效的扩增线粒体DNA高可变区(mtDNA HVR)的方法.方法:本研究选取5例健康成人静脉血,用人血全基因组DNA试剂盒,提取全基因组DNA,设计引物,用复合PCR方式,对线粒体DNA中的高可变区进行扩增.复合扩增的方式为:用6对套叠引物分开进行两次独立的PCR,扩增mtDNA HVR.第一次扩增用3对引物,目标DNA片段基本涵盖整个线粒体DNA的高可变区,扩增后得到互不重叠的3个短片段,分别为113 bp,126 bp和131bp.第二次复合扩增用其余的3对引物,目标片段基本重叠在第一次扩增所得的目标片段的区域内,扩增得到3个互不重叠的片段为124 bp,133 bp和93bp.所有扩增产物经过纯化后测序.结果:复合PCR方式获得的mtDNA HVR基因序列完整,5个样本均出现特异性条带,电泳结果条带单一、清晰.结论:复合扩增PCR方法对mtDNA HVR区的扩增效率高,测序结果稳定,结合6对套叠引物,不但保证了序列的完整性,另外,两次独立的PCR也减少了PCR反应过程中错配的发生,此法也适用于保存时间较久的古代线粒体DNA短片段的研究.复合扩增PCR还展示出了潜在的高产量的特点,相对传统PCR显示了其更多的优势.     

两种缢蛏线粒体基因全序列扩增方法的比较

介绍了应用长PCR技术扩增缢蛏线粒体全序列的两种方法,并进行了比较.一种方法是使用通用引物扩增COI基因和16S基因并测序后,在两基因的两端分别设计两对引物扩增两基因中间的大片段,分别得到了9.7 kb和7.3 kb的扩增产物.另一种方法是在COI基因序列两端设计一对引物,扩增整个线粒体全序列,得到了17.1 kb的扩增产物.两种方法在缢蛏的研究中进行比较后发现,前一种方法在操作实用性和后期测序方面都比后者好.     

DNA 12S rRNA基因序列测定在野生动物毛发样本鉴定中的应用

目的利用mtDNA 12S rRNA基因序列测定法对西藏自治区森林公安局送检的三件毛发物证进行种属鉴定,并探讨该方法在无毛囊毛发样本鉴定中的应用价值。方法用酚/氯仿法从毛发样本中提取出基因组总DNA,再用一通用引物通过PCR技术扩增mtDNA上12S rRNA基因的部分片段并进行序列测定。测序结果在GenBank上进行BLAST搜索,再利用DNAMAN软件进行同源性分析。结果1号样和3号样扩增产物序列与藏原羚的线粒体DNA的12S rRNA基因序列的部分片段的同源性均高达99%;2号样的序列与盘羊的线粒体DNA的12S rRNA基因序列的部分片段的同源性高达98%。结论1号和3号样为藏原羚,2号样为盘羊。本研究所用方法在野生动物案件的样本鉴定中有极高的应用价值。     

利用两种不同引物扩增金龟子COⅠ序列片段的研究与对比

利用两类不同的引物,即通用引物(L1490,H2198)与特异引物(Pat,Jerry)分别对4种常见金龟子线粒体细胞色素C氧化酶I(COⅠ)基因片段序列进行扩增和测序,获得长度为689 bp与775 bp的序列。对测序结果进行遗传距离分析,并构建了4种金龟子系统进化树。结果表明,特异引物扩增序列的遗传距离在种内稳定性与种间的差异性都明显优于通用引物扩增序列,利用特异引物扩增序列所构建的系统进化树最符合实际情况,因此利用特异引物扩增序列更能够准确的对金龟子进行分类。     

人参细胞器核糖体小亚单位DNA的PCR扩增与序列测定

采用CTAB法提取了人参(Panax ginseng)根基因组DNA,根据植物叶绿体16S rDNA和线粒体18SrDNA与细菌16S rDNA序列具有高度同源性,用扩增细菌16S rDNA的一对通用引物(8f,1492r)扩增了人参细胞器核糖体小亚单位DNA.对扩增产物进行了克隆与测序,经多序列比对,扩增片段分别与已知植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA具高度同源性,表明该对引物可以用来扩增绝大多数植物细胞器核糖体小亚单位DNA,可以作为鉴定植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA的一种基本实验技术.     

利用两种不同引物扩增金龟子COI序列片段的研究与对比

利用两类不同的引物,即通用引物(L1490,H219S)与特异引物(Pat,Jerry)分别对4种常见金龟子线粒体细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段序列进行扩增和测序,获得长度为689 bp与775 bp的序列.对测序结果进行遗传距离分析,并构建了4种金龟子系统进化树.结果表明,特异引物扩增序列的遗传距离在种内稳定性与种间的差异性都明显优于通用引物扩增序列,利用特异引物扩增序列所构建的系统进化树最符合实际情况,因此利用特异引物扩增序列更能够准确的对金龟子进行分类.     

裸长角(虫兆)线粒体COI基因扩增的研究

目的:为研究跳虫的遗传多样性和探讨跳虫线粒体基因提取与扩增的简易方法,对裸长角(虫兆)线粒体细胞色素氧化酶亚基COI基因进行了提取和扩增.方法:通过采集裸长角(虫兆)、提取裸长角虫兆基因组DNA,并用特异性引物对COI基因进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳来检验扩增产物,最后用软件对结果进行分析.结果:结果显示扩增产物的为一明亮条带,长度约为477bp,符合预期.结论:用基因组DNA作为扩增模板是可行的,所选用的引物对跳虫线粒体细胞色素氧化酶基因的扩增具有参考价值.     

扬子鳄鞣制皮革和鳞片的DNA提取方法

运用一种改进的提取方法 ,作者从鞣制皮革中成功地提取了总DNA ,同时还对尾尖皮、鳞片、盐腌生皮等皮质进行了DNA提取 ;用 12SrRNA基因扩增的通用引物、扬子鳄鉴别引物、微卫星引物及RAPD引物进行PCR扩增 ,并对部分扩增结果进行测序 ,以检验提取效果。结果证明 ,几种皮质标本都可提取出DNA ,其中尾尖皮和鳞片的提取效果较好 ,用四种引物都可扩增出明显亮带 ;盐腌生皮和鞣制皮提取结果也很好 ,并且用12SrRNA通用引物、扬子鳄鉴别引物扩增的亮带较明显 ,可进行扬子鳄皮质用品等的分子鉴定及部分序列的扩增和测序研究     

基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成中多位点缺失突变的校正方法

目的:建立一种PCR方法,以快速校正基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的多位点缺失突变。方法:用PCR方法合成基孔肯雅病毒非结构蛋白基因;对测序的克隆进行序列比对,分析不同克隆上缺失突变发生的位置,以保守区域互相重叠的寡核苷酸为上下游引物、以该区域测序正确的克隆为模板进行PCR扩增,得到所需片段,再将这些片段用PCR方法进一步组装成完整的基因序列并进行测序。结果:测序结果表明,经过2次PCR扩增,校正了基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的5个位点缺失突变。结论:得到序列正确的基孔肯雅病毒非结构蛋白基因。在进行基因合成过程中如发生多位点缺失突变,可利用该方法同时对以上突变进行校正,无须再合成引物,降低了实验操作难度,并提高了实验效率。     

PCR直接测序方法及其在肿瘤研究中的应用

PCR直接测序技术是PCR扩增与核酸测序技术相结合的一种方法.根据此技术的原理,建立了一种以PCR扩增引物为测序引物,α-³⁵S dATP直接掺入,Taq DNA聚合酶直接测序PCR扩增产物的方法.实验表明:该方法简便、快速、稳定.用此方法对人食管癌组织中的抗癌基因p53进行了突变测序分析,发现食管癌组织中p53存在点突变,插入、丢失移码突变.并用此方法对人和恒河猴的p53内含子序列进行了测定,发现猴第5内含子为81个核苷酸,第8内含子为92个核苷酸.     

重伞灵芝线粒体基因组在灵芝种间鉴定中的应用

线粒体是“动力工厂”,能够进行氧化代谢实现能量的转化,参与三羧酸循环形成ATP。随着分子生物学和生物信息学技术的发展,担子菌灵芝属中已有几种灵芝的线粒体基因组被相继报道,但尚未有对重伞灵芝线粒体基因组的报道。本研究通过对重伞灵芝YX线粒体基因组进行组装注释,比较分析了与其他灵芝属物种的差异,根据差异序列构建分子标记对重伞灵芝菌株快速鉴定。结果显示重伞灵芝线粒体基因组大小为67 340bp的闭合环形结构,含有15个普通蛋白编码基因,28个tRNA基因,以及rRNA的大小亚基基因。共5个基因含有12个内含子,主要为IB型,部分为ID型,包含LAGLIDADG_1 superfamily、GIY-YIG_Cterm superfamily保守结构域。根据重伞灵芝线粒体cox2基因设计的特异性引物扩增结果显示：4株重伞灵芝的cox2基因片段均可准确扩增,且扩增不出其他灵芝物种的cox2基因片段。基于各灵芝菌株线粒体cox2基因序列构建系统进化树,可以将4株重伞灵芝归在同一分支上,并且同源性为98%,与ITS鉴定结果一致。可见,基于线粒体基因cox2特异性引物可以快速地对重伞灵芝进行鉴定,且只需通过观察扩增条带的有无,无需测序,省时省力。