荧光素酶及其应用

介绍了细菌荧光素酶基因(lux)和萤火虫荧光素酶基因(luc)的结构特点和二者的差异,概述了该酶作为报告基因在基础研究和实践(污染物监测、急性毒性和遗传毒性监测、微生物监测等)中的应用,肯定了该酶作为报告基因的广阔应用前景。     

荧光素酶研究进展*

荧光素酶 (Luciferase)可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。萤火虫荧光素酶是分子量为 60～ 64kD的多肽链 ,在Mg²⁺、ATP、O₂ 存在时 ,催化D 荧光素 (D Luciferin)氧化脱羧 ,发出光 (λ =550～580nm)。细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的加单氧酶 ,它催化长链脂肪醛、FMNH₂ 和O₂ 的氧化反应 ,发出绿蓝光 (λ =490nm)。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶     

荧光素酶研究进展

荧光素酶（Luciferase）可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。萤火虫荧光素酶是分子量为60－64kD的多肽链,在Mg^2 、ATP、O2存在时,催化D－荧光素（D－Luciferin）氧化脱羧,发出光（λ=550-580nm）。细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的加单氧酶,它催化长链脂肪醛、FMNH2和O2的氧化反应,发出绿蓝光（λ=490nm）。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶可分别从萤火虫和发光细菌中直接提前,亦可用基因工程的方法进行生产。荧光素酶催化的发光反应能用生物发光检测仪进行灵敏、快速检测,因此该酶有多方面的途径,如应用于快速检测、报告基因分析、有毒有害物质分析等。     

在大肠杆菌中合成的萤火虫荧光素酶的分离和性质

用生物工程技术将萤火虫荧光素酶基因转移到大肠杆菌,在大肠杆菌中合成荧光素酶。这种工程菌已可通过发酵大量培养,并从菌体分离得到接近纯化的荧光素酶。这种酶的分子量是103kD;巯基试剂5,5’-巯基-2(2-硝基苯甲酸)“DTNB”能抑制酶的活性;对于底物荧光素的K_m为1.2μmol/L;酶反应最适pH为7.77;酶催化的生物发光峰在560nm。     

抗除草剂基因和荧光素酶基因在小麦愈伤组织中的稳定表达

用ＰＥＧ介导法将抗除草剂基因和萤火虫荧光素酶基因转入小麦原生质体,在含５０ｍｇ／Ｌ Ｂａｓｔａ的培养基上筛选出有抗性的愈伤组织。ＤＮＡ分子杂交结果表明ｂａｒ基因和ｌｕｃ基因都已整合到小麦细胞基因组中,萤火虫荧光素酶活性测定也检测到ｌｕｃ基因的表达。     

β- 萘黄酮能抑制荧光素酶活性

目的:研究β-萘黄酮对荧光素酶活性的影响。方法:利用人GCLC基因调控序列驱动的GCLC-PGL3-enhancer-Luciferase报道载体(PL45)转染人肺腺癌细胞A549,人肝癌细胞HepG2,人子宫颈癌细胞HeLa,人乳腺癌细胞MCF-7,人肝癌细胞Bel-7402,人支气管上皮细胞16HBE,β-萘黄酮刺激后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对GCLC基因表达的影响。wester blot检测β-NF刺激16HBE细胞后GCLC蛋白水平的变化。β-萘黄酮刺激转染了表达Luciferase的真核表达载体pRC/CMV2-luc+的A549和HepG2细胞后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因表达的影响。PL45转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用β-NF刺激,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因的影响。结果:在各种细胞中,转染PL45报道载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降(P<0.01)。wester blot结果显示β-NF处理组GCLC蛋白的表达较DMSO对照组明显升高。在A549和HepG2细胞中,转染pRC/CMV2-luc+载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降(P<0.01)。PL45转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用β-NF刺激,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降(P<0.01)。结论:β-萘黄酮直接抑制了荧光素酶的活性     

中国萤火虫云南窗萤荧光素酶cDNA的克隆表达和序列分析

从一种来自中国日行性萤火虫(云南窗萤)发光器官mRNA中克隆、测序并表达了有功能的荧光素酶.云南窗萤荧光素酶的cDNA序列有1647个碱基,编码548个氨基酸残基.从推测得到的氨基酸序列的比对分析得出:云南窗萤的荧光素酶与来自Lampyris noctiluca,L.turkestanicus和Nyctophila cf.caucasica三种萤火虫的荧光素酶有97.8%的序列一致性.从推测得出的氨基酸序列进行系统发育分析,其结果表明:云南窗萤和Lampyris Nyctophila聚在一起,与同属的发光强夜行性的萤火虫不形成的单系.云南窗萤荧光素酶在大肠杆菌中表达的条带大约70kDa,并且在有荧光素存在时发出黄绿色荧光.对荧光素酶的结构模拟和分析表明,云南窗萤荧光素酶基因的氨基端和羧基端结构域之间的裂沟处存在这5个多肽环,这正是从其他荧光素酶推测得到的催化荧光反应时的底物结合位点.云南窗萤和窗萤属的其他3种萤火虫的荧光素酶卡目比,有13个不同氨基酸位点,位于模拟分子结构的表面.对于这些多肽环、不刚氨基酸残基和晶体结构的进一步研究有利于解释日行和夜行性萤火虫荧光素酶的差异.     

稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因细胞株的建立

目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选以获得单细胞抗性克隆并在传代过程中能稳定表达荧光素酶活性;检测细胞荧光素酶表达与细胞数量相关性;PCR检测稳定细胞株基因组已整合的插入片段;刺激因子刺激6h,检测稳定细胞株的反应性。结果:成功构建PGL4.19-GCLC-LUC;构建的稳定细胞株能稳定地表达荧光素酶,且与细胞数量正相关;PCR检测稳定细胞株目的片段稳定整合基因组;TNF-α刺激后,能使荧光素酶活性上升,差异有统计学意义(P0.05);Rapamycin,GSH-EE刺激后,荧光素酶活性显著下降(P0.05)。结论:成功构建稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因的细胞株,将为高通量药物筛选以及进一步研究GCLC基因的转录调控提供重要的细胞研究手段。     

耐热荧光素酶的表达及热稳定焦磷酸测序体系的建立

焦磷酸测序是一种基于生物发光反应的实时DNA序列测定技术,其反应体系中的荧光素酶决定测序反应的灵敏度。传统焦测序反应使用的是野生型北美荧光素酶Photinus pyralis luciferase(PpL),该酶热稳定性较差,因此由该酶配制的焦磷酸测序反应体系对热不稳定,影响焦磷酸测序的灵敏度。为了建立热稳定的焦磷酸测序反应体系,全合成了耐热突变日本萤火虫荧光素酶的编码序列,并将其插入到表达载体pET28a(+)中构建重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌中,筛选得到的阳性重组菌成功表达了N端带有6×His(组氨酸)标签的耐热突变日本萤火虫荧光素酶。利用镍亲和层析法,纯化得到了分子量约为60 kDa且比活为4.29×1010RLU/mg的重组蛋白。对重组耐热日本萤火虫荧光素酶的热稳定性研究结果表明,该酶在50℃时仍具有活性,在40℃下孵育25 min后活性保留了90%以上。与基于野生型北美荧光素酶的焦磷酸测序体系相比,由耐热日本萤火虫荧光素酶配制的测序反应体系对热稳定性有了极大的提高,该测序反应液在37℃放置1 h后仍能够得到正确的测序结果。研究结果为建立稳定可靠的现场及时快速焦磷酸测序反应体系奠定了基础。     

荧光素浓度对于用荧光素酶测定ATP含量的影响

在粗荧光素酶液中加合成的荧光素和不加荧光素,观察其发光反应动力学,反应系统中外加荧光素后,发光强度明显增加,以适当低浓度的荧光素酶液的发光强度增加最大。在室温(20℃)下,不同贮放时间的荧光素酶液,其反应活性随贮放时间的延长而下降。外加荧光素后,反应活性可以恢复并达到最大后保持恒定。在-15℃贮放一年后的荧光素酶粉剂,反应活性下降,外加荧光素后,反应活性可以提高到原来的水平。     

荧光素酶基因的研究进展

主要从荧光素酶报告基因的种类和结构、发光机制以及在科学研究中的应用3个方面对荧光素酶报告基因的研究进展作简单介绍。着重介绍了荧光素酶作为报告基因在基因表达研究、药物筛选研究、标记微生物（示踪）、蛋白质相互作用研究、RNA干扰研究、标记细胞活体成像等方面的应用;并对荧光素酶报告基因的应用研究作了展望。     

采用双荧光素酶报告法验证乳腺癌中miR-155靶标

MiR-155与乳腺癌发生发展密切相关. 本研究以乳腺癌组织和血清中均显著高表达的miR 155为研究对象,利用TargetScan和PicTar预测miR 155的靶基因. 根据miR 155与靶基因结合的保守性、动力学及靶基因功能,筛选出miR 155的靶基因ACTA1（actin alpha 1, skeletal muscle）和CEBPB（CCAAT/enhancer binding protein beta）,并用双荧光素酶报告法验证. 将ACTA1和CEBPB的3′-UTR（3′-untranslated region）全长序列载入海肾荧光素酶基因的下游,并构建结合位点的突变序列,得到pRL-TK-Aw、pRL-TK-Am、pRL-TK-Cw、pRL-TK-Cm载体.不同海肾荧光素酶载体转染Bcap37乳腺癌细胞,同时转染miR-155及内参对照萤火虫荧光素酶载体pGL3-control. 根据不同转染的海肾荧光素酶表达活性,运用SPSS软件分析,结果显示,CEBPB是miR-155在乳腺癌中的直接靶基因（P< 0.05）. miR-155通过下调CEBPB影响乳腺癌的发生.     

中国萤火虫云南窗萤荧光素酶cDNA的克隆表达和序列分析(英文）

从一种来自中国日行性萤火虫（云南窗萤）发光器官mRNA中克隆、测序并表达了有功能的荧光素酶。云南窗萤荧光素酶的cDNA序列有1 647个碱基,编码548个氨基酸残基。从推测得到的氨基酸序列的比对分析得出：云南窗萤的荧光素酶与来自Lampyris noctiluca, L. turkestanicus和Nyctophila cf. caucasica三种萤火虫的荧光素酶有97.8%的序列一致性。从推测得出的氨基酸序列进行系统发育分析,其结果表明：云南窗萤和Lampyris+Nyctophila聚在一起, 与同属的发光强夜行性的萤火虫不形成的单系。云南窗萤荧光素酶在大肠杆菌中表达的条带大约70 kDa,并且在有荧光素存在时发出黄绿色荧光。对荧光素酶的结构模拟和分析表明,云南窗萤荧光素酶基因的氨基端和羧基端结构域之间的裂沟处存在这5个多肽环,这正是从其他荧光素酶推测得到的催化荧光反应时的底物结合位点。云南窗萤和窗萤属的其他3种萤火虫的荧光素酶相比,有13个不同氨基酸位点,位于模拟分子结构的表面。对于这些多肽环、不同氨基酸残基和晶体结构的进一步研究有利于解释日行和夜行性萤火虫荧光素酶的差异。     

β-萘黄酮能抑制荧光素酶活性

目的：研究β-萘黄酮对荧光索酶活性的影响。方法：利用人GCLC基因调控序列驱动的GCLC．PGL3．enhancer-Luciferase报道载体（PL45）转染人肺腺癌细胞A549,人肝癌细胞HepG2,人子宫颈癌细胞HeLa,人乳腺癌细胞MCF-7,人肝癌细胞Bel-7402,人支气管上皮细胞16HBE,β-萘黄酮刺激后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对GCLC基因表达的影响。westerblot检测β-NF刺激16HBE细胞后GCLC蛋白水平的变化。β-萘黄酮刺激转染了表达Luciferase的真核表达载体pRC／CMV2．1uc＋的A549和HepG2细胞后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因表达的影响。PIA5转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用p-NF刺激,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因的影响。结果：在各种细胞中,转染PL45报道载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降（p〈0．01）。westerblot结果显示β-NF处理组GCLC蛋白的表达较DMsO对照蛆明显升高。在A549和HepG2细胞中,转染pRC／CMV2．1uc＋载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降（P〈0．01）。PIA5转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用β-NF刺激,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降（P〈0．01）。结论：β-萘黄酮直接抑制了荧光素酶的活性     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5′NCR调控荧光素酶基因的表达

目的:分析丙型肝炎病毒(HCV)5′端非编码区(NCR)的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用。方法:以质粒pCMVN CRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5′端20nt和43nt的HCV 5′NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5′NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5′NCR调控萤火虫荧光素酶(luc)基因表达的真核表达质粒(pCN1-d1、pCNl-d2)。以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平。结果:酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功。各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNRluc相比差异无显著性(P＞0．05);pCNl-dl、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性(P＞0．05)。结论:HCV 5′NCR的5′端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5'NCR调控荧光素酶基因的表达

目的:分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(NCR)的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法:以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5'端20nt和43nt的HCV 5'NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5'NCR调控萤火虫荧光素酶(luc)基因表达的真核表达质粒(pCNl-d1、pCNl-d2).以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果:酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性(P＞0.05);pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性(P＞0.05).结论:HCV 5NCR的5'端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

荧光素酶可能是有用的工具

经遗传工程的烟草植株,由于在黑暗中能发光而呈现出美丽的图象。这项成就对于想知道植物或动物细胞什么时候进行基因表达的研究人员来说,其价值是不能低估的。Sun Diego加利福尼亚大学的Stephen H.Howell及其同事用Ti质粒将萤火虫荧光素酶基因转移到烟草植株细胞中,这些细胞的再生植株把荧光素酶基因传给了它们的后代。若把虫荧光素供给转化植株,(虫荧光素是在萤火虫里发现的另一物质)则在荧光素酶基因表达荧光素酶之     

小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。     

基于萤火虫荧光素酶报告基因检测凋亡的系统构建及鉴定

为构建一个能够快速检测凋亡的含荧光素酶报告基因 (Fluc) 的真核表达质粒,采用PCR的方法将Caspase-3的识别基序Asp-Glu-Val-Asp (DEVD) 四个氨基酸引入至Fluc基因的C端和N端之间;同时选取Asp-Glu-Val-Gly (DEVG) 四个氨基酸作为阴性对照。随后重组片段分别克隆至分离型内含肽的N端和C端之间,并命名为pFluc-DEVD和pFluc-DEVG。将该表达质粒与海肾荧光素酶报告质粒 (RLUC) 同时转染至HeLa细胞,通过双荧光素酶报告基因和Western blotting实验检测细胞凋亡水平。双荧光素酶报告基因系统实验结果显示,当发生凋亡时,pFluc-DEVD质粒组表达的萤火虫荧光素酶的含量高出pFluc-DEVG质粒组约3倍。Western blotting检测结果显示,转染pFluc-DEVD质粒的细胞在凋亡药物刺激后,Fluc活化的蛋白显著增多,且Caspase-3 的活化程度与Fluc的表达呈正相关,并有显著的统计学差异。以上结果表明,pFluc-DEVD真核表达质粒表达的萤火虫荧光素酶蛋白能被细胞内的Caspase-3酶裂解,且该质粒能够精确地反映出细胞的凋亡水平,为后续进行凋亡定量检测提供了一个可借鉴的方法。     

表达马传染性贫血病毒受体和荧光素酶报告基因的293细胞系的建立

为了在体外精确、简便地测定马传染性贫血病毒(EIAV)的中和抗体和研究不同毒株与受体的亲和性,克隆了马慢病毒受体1(ELR1)cDNA并插入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建了表达载体pELR1。该载体瞬时转染293细胞后,经Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测,确认了ELR1的表达。在pELR1质粒的基础上,插入EIAV疫苗株前病毒基因组转录调控区LTR以及萤火虫荧光素酶报告基因(Luc)构建了表达载体pELR1-LTR-Luc,并转染293细胞,建立了ELR1-LTR-Luc(293-E)细胞系。该细胞系能稳定表达ELR1基因,并且能在LTR的调控下表达萤火虫荧光素酶基因。用1000TCID50的EIAV驴胎皮肤细胞疫苗株D18V13接种该细胞,24h后检测其荧光素酶活性是未接毒对照的3.15倍。同时用IFA检测证明了病毒在细胞内的增殖。EIAV强毒株L21的接毒试验显示,ELR1-LTR(293-E)细胞的萤火虫荧光素酶活性与该毒株的接毒量在10-2~10-7稀释范围内呈正相关。该细胞系传35代后,外源基因的表达特征未发生改变。该细胞系的建立为进一步开展EIAV与细胞受体相互作用以及中和抗体评价等研究奠定了重要基础。