外源BoCAL基因对花椰菜花球形态发生的调节及其遗传

花椰菜和结球甘蓝是芸薹属甘蓝种的两个变种,前者的BoCAL基因发生提前终止突变而失去了原有的功能,而后者的BoCAL基因具有完整的编码区。在农杆菌的介导下,我们获得了BoCAL转基因花椰菜。T2代的遗传研究表明,外源BoCAL基因转入后花椰菜转基因植株都没有形成花球,而是只形成松散的由花蕾组成的绿色花序。这一结果说明,花椰菜BobCAL被甘蓝BoCAL互补了,转基因花椰菜因此失去了形成花球的能力。这些转基因植株自交到T3代时花序的形态特征与T2代一致,为松散的绿色花序,但是花序出现的时间与T1代相比提早了15天。将转基因花椰菜与野生型花椰菜杂交,结果发现杂交后代的植株形成夹杂有花蕾的花球,且花序出现的时间大大推迟,在播种后135天后才形成花球。     

与花球发生相关的BoCAL和BoAP1互作因子的筛选

CAL(CAULIFLOWER)基因与AP1(APETALA1)基因都是控制花分生组织发育的基因,二者都属于MADS-box转录因子编码基因,在拟南芥中,它们同时突变时会使花分生组织保持花序分生组织的无限分生特性,大量增生分生组织结构,形成花球表型。而花椰菜(Brasscia oleracea L.var.botrytis)中BobCAL基因单突变就能形成花球,显然两个物种中CAL的功能可能不同。为了研究芸苔属植物中CAL和AP1同源蛋白的功能,尤其是在花球形成方面的调控作用,我们利用酵母双杂交方法对拟南芥中结球甘蓝(B.oleracea vat capitata L.)BoCAL的互作因子进行了筛选。与BoCAL互作较强的四类蛋白,分别涉及蛋白质的磷酸化和去磷酸化、蛋白质的修饰、蛋白质的结合位点等,它们分别与转录调控途径及信号转导途径有着密切的联系,这些因子的获得为BoCAL作用机制研究提供了线索。我们同时检测了部分BoCAL的互作因子和BoAP1之间的互作关系以及部分已知的MADS盒转录因子分别与BoCAL和BoAP1的互作,结果表明BoCAL特异性地与SnRKβ2互作,BoCAL、BoAP1和拟南芥中同源蛋白都能与SVP互作,但与拟南芥中同源蛋白不同的是,BoCAL、BoAP1与FLM、SOC1(SUPPRESSOR OF CO OVEREXPRESSION 1)和AGL24(AGAMOUS-LIKE24)作用很弱或不能互作,暗示BoCAL和BoAP1与拟南芥中同源蛋白功能上是不同的。     

转不可翻译PVYN CP基因烟草的抗病性分析

我们曾报道表达不可翻译PVY~N CP基因的转基因烟草抗病性是由RNA介导的,其抗病性类似于转录后的基因沉默(PTGS)。本研究以这类不同抗性的Tn代转基因烟草植株为材料,对自交后的T1代转基因植株的遗传和抗病性进行了分析,并选取部分T_1代抗病株系自交留种。对T_2代RNA介导抗病性转基因植株进行了分子分析和一系列抗病性研究。结果表明,含1-2个转基因拷贝的T_0代感病植株,在T_1代中的Km抗性分离符合单位点插入的3∶1的遗传规律;含3个或3个以上转基因拷贝的T_0代中抗或高抗植株,在T_1代中的Km抗性分离符合多位点插入的15∶1或63∶1的遗传规律。大多数T_1、T_2代转基因植株的抗病性与转基因拷贝数成正相关,转基因在T_1、T_2代植株中能够转录表达,且转基因植株之间转基因mRNA在细胞质中的积累水平与转基因植株的抗病性成负相关。转基因植株的抗病性能够在T_1、T_2代中遗传,且T_2代转基因植株的抗病性具有以下特征:1)既抗病毒粒体又抗病毒RNA的侵染,且这种抗病性不受接种物剂量的影响;2)抗病谱较窄,只对PVY的某些株系具有高度抗病性;3)与传毒方式无关,既抗摩擦接种又抗带毒蚜虫接种;4)与植株的发育阶段没有关系。     

食用花菜花球形成的生理基础

食用花菜主要有花椰菜（Brassicaoleraceavar.botrytise）和青花菜（B.oleraceavar．italica）。花椰菜又称菜花和花菜,其食用部分是一个由许多花轴、花枝、花蕾短缩聚合而成的肥厚花球。青花菜又名茎椰菜,嫩茎花椰菜,木立花椰菜、意大利芥蓝。它的食用部分为带有花蕾群的嫩茎,花球绿色,故又称绿菜花。1花芽分化与花球形成花椰菜、青花菜的花芽分化是获得产品器官花球的前提。一般经过一定的营养生长后,就开始进行花芽分化。据何承坤等人「”连续用石蜡切片和电镜扫描的方法对花棚菜的早、中、晚3个品种进行的研究结果表明,花椰案的…     

农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化甘蓝的研究

为获得抗旱和耐盐性提高的甘蓝植株,通过农杆菌介导法将来自菠菜的甜菜碱醛脱氢酶（Betaine Aldehyde Dehydrogenase,BADH）基因导人甘蓝品系03079,并采用正交设计优化影响转化效率的参数,建立了甘蓝高效转化体系,即以侵染液为AA液体培养基、乙酰丁香酮200μmol L^-1、侵染时间20min、共培养天数2d为最佳转化参数,在该条件下转化率可达54．26％。转基因甘蓝植株经PCR检测初步说明BADH基因已导入甘蓝中,Southern杂交证明BADH基因已稳定整合到甘蓝基因组中。甜菜碱脱氢酶活性测定结果表明,经过聚乙二醇（PEG）、NaCI和干旱处理的转基因甘蓝植株的BADH酶的平均比活力范围在2．1Umg^-1～3．6Umg^-1之间,不同处理的转基因株系酶比活力显著高于相应的未转基因株系。膜的相对电导率测定结果说明,经过PEG、NaCl和干旱处理的转基因植株平均相对电导率在16．2％～32．6％之间,耐逆境胁迫处理后的绝大多数转基因株系相对电导率显著低于相应对照。多数转BADH基因甘蓝植株在干旱、盐胁迫和PEG胁迫条件下生长势强于未转基因植株,表现为大多数转基因株系株高增幅显著高于对照,说明BADH基因的导入能提高转基因甘蓝植株的抗旱和耐盐性。我们获得的抗旱和耐盐能力明显提高的转基因甘蓝植株,可作为培育耐盐、抗旱甘蓝品种的种质材料。     

蒙古冰草MwMYB4基因功能鉴定

MwMYB4基因是从蒙古冰草中克隆得到的MYB类转录因子家族成员之一。该研究以转MwMYB4基因的拟南芥后代为材料,通过在干旱和低温胁迫下对转基因植株进行表型分析、理化指标测试和分子鉴定,分析并验证MwMYB4基因的功能。结果显示:(1)蒙古冰草MwMYB4基因已成功整合到转基因拟南芥T_1代的基因组中并实现转录水平的表达。(2)转基因拟南芥T_2代植株在干旱胁迫条件下,转基因植株叶片枯黄程度较轻,相对电导率较野生型变化幅度低,脯氨酸含量明显高于野生型对照,且MwMYB4基因的表达量随干旱胁迫时间延长而增加。(3)在低温胁迫条件下,转基因拟南芥叶片的枯白程度明显低于野生型,且MwMYB4基因的表达量随低温胁迫时间增加而增加。研究表明,过量表达蒙古冰草MwMYB4基因能够提高转基因拟南芥对干旱和低温的耐受性,该基因可能在干旱胁迫和低温胁迫调控机制中发挥调控作用,可作为改良农作物和其他牧草抗旱、抗寒性的重要候选基因。     

甘蓝转生长素基因系自交后代叶球和根系的发育特征

甘蓝转生长素基因系Ｇ４３２５的基因组内插入有发根农杆菌ｐＲｉ质粒上的生长素合成酶基因。该转基因自交后,其Ｍ２代的植株仍保留异常的形态和生理特征。它们与未转化的正常植株相比,结球期提前,叶球变小,紧实度增加,外叶趋向松散的抱合,侧根数增多;腋芽扦插时不定根发生早而多,成活率显著高于对照;     

抗虫转基因甘蓝及其后代的研究

通过农杆菌感染法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因转移进了甘蓝的基因组,带子叶柄的子叶作为外植体与农杆菌共培养.发生在子叶柄基部的愈伤组织在含卡那霉素(Km)15～30mg/L的MS培养基上进行筛选,约5%外植体上的愈伤组织继续长大,当移到含Km和6-BA的分化培养基上时,愈伤组织分化出绿色的芽.将芽分离培养,约80%在加有Km的培养基上被诱导生了根.未转化的对照组织在筛选培养基上不能分化出正常的芽和根系,并且逐渐褐化死亡.小菜粉蝶的幼虫被饲喂以转基因植株的叶片,幼虫出现中毒症状,表现为发育受阻和死亡.约20%受试植物的DNA与苏云金杆菌杀虫蛋白基因探针杂交显阳性带.由转基因植株的种子长成的第2代甘蓝幼苗的卡那霉素抗性和植株的抗小菜粉蝶的活力均符合孟德尔单基因分离规律.     

棉花乙烯合成基因促进拟南芥和烟草不定根发生的研究

从棉花纤维cDNA中克隆获得乙烯合成基因GhACO3,构建了植物过量表达载体p35S::GhACO3.通过花序侵染法和叶盘法分别转化拟南芥和烟草,利用卡那霉素筛选及分子检测获得转基因阳性拟南芥和烟草植株.结果表明,GhACO3基因已整合到拟南芥和烟草基因组中;经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株;与野生型拟南芥相比,GhACO3基因对拟南芥不定根发生具有显著促进作用;与野生型烟草植株相比,转GhACO3基因烟草不定根发生得到了显著的促进.研究表明,GhACO3基因的过量表达能够促进拟南芥和烟草不定根的形成发育,为进一步探讨GhACO3的生物学功能和进行转基因育种奠定了基础.     

转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因抗虫基蓝植株的获得

利用根癌农杆菌介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂（ＣｐＴＩ）基因导入甘蓝栽培品种“京丰”和“迎春”,并分别获得了转基因再生植株。对ＮＰＴⅡ的ＥＬＩＳＡ检测表明,标记基因ＮＰＴⅡ已在再生植株中得到有效表达。对转化植株进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交实验进一步证明ＣｐＴＩ基因已整合到甘蓝的基因组。实验室内的叶片离体饲虫及盆栽饲虫试验表明,转基因甘蓝对菜青虫具有一定抗性。实验中还观察到,采用愈伤组织分化途     

芸苔属植物CAL基因的结构特征与花球的形态遗传

Cauliflower curd is composed structurally of a number of shortened shoots on which there are tremendous amount of naked apical meristems. The authors isolated four pure lines of different curd types from cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis) accessions: smooth curd (curd-s), haired curd (curd-h), crystal curd (curd-c) and thorned curd (curd-t). BobCAL genes was cloned separately from each pure line by PCR amplification and a termination mutation from AAG to TAG was found in the fifth exon of all four sequences, whereas DNA sequences of 638 bp upstream of the stop codons were identical, demonstrating that BobCAL is not the sole regulator of flower buds and cauline on curd. After crosses of cauliflower with cabbage (B.oleracea var. capitata) or broccoli (B.oleracea var. italica), the resultant F1 plants failed to form curd and had the diversity of inflorescence which implicates the relatedness of CAL to other regulators. One homologous gene of CAL, BcpCAL was isolated from Chinese cabbage (B.campestris L. ssp. pekinensis) and it was found not to have the termination mutation in the fifth exon, and thus the structure of BcpCAL gene was analyzed. The results offer molecular and genetic evidence for the study of biological function of CAL and morphological genetics of curd.     

芸薹属植物发育过程中顶端结构的解剖学研究

本文采用解剖学方法研究花椰菜、青花菜、结球甘蓝和大白菜在生长发育过程中顶端分生组织结构的变化及之间存在的差异。结果显示它们的顶端分生组织结构都是由最初幼苗的原套-原体结构逐渐发育到过渡型分区结构、典型化五个分区结构,至开始进入生殖生长时期的四个分区结构(形成层状细胞区消失)。四种植物在进入生殖生长后,顶端分生组织细胞行为不同:大白菜和甘蓝顶端亚外套两侧细胞分裂分化形成顶生叶原基,在顶生叶原基内侧的细胞将进行分裂产生花序侧枝原基。花椰菜和青花菜顶端亚外套两侧细胞分裂形成花序分生组织,花序分生组织增生即为花球体;内部解剖结构表现为分生组织不断分裂增多的过程。这些结果为研究花序表型发生的解剖学本质及分子生物学研究分生组织发育方向奠定了基础。     

Variation and selection at the CAULIFLOWER floral homeotic gene accompanying the evolution of domesticated Brassica oleracea

The evolution of plant morphologies during domestication events provides clues to the origin of crop species and the evolutionary genetics of structural diversification. The CAULIFLOWER gene, a floral regulatory locus, has been implicated in the cauliflower phenotype in both Arabidopsis thaliana and Brassica oleracea. Molecular population genetic analysis indicates that alleles carrying a nonsense mutation in exon 5 of the B. oleracea CAULIFLOWER (BoCAL) gene are segregating in both wild and domesticated B. oleracea subspecies. Alleles carrying this nonsense mutation are nearly fixed in B. oleracea ssp. botrytis (domestic cauliflower) and B. oleracea ssp. italica (broccoli), both of which show evolutionary modifications of inflorescence structures. Tests for selection indicate that the pattern of variation at this locus is consistent with positive selection at BoCAL in these two subspecies. This nonsense polymorphism, however, is also present in both B. oleracea ssp. acephala (kale) and B. oleracea ssp. oleracea (wild cabbage). These results indicate that specific alleles of BoCAL were selected by early farmers during the domestication of modified inflorescence structures in B. oleracea.     

Genetic improvement of heavy metal tolerance in plants by transfer of the yeast metallothionein gene (CUP1)

Cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis) tolerates treatment with 25 µM CdCl2 for eight days, but is killed by that with a 50 µM concentration. However, even 15 µM CdCl2 is toxic in the presence of 1 mM L-buthionine sulfoximine (BSO), suggesting the presence of a Cd-inducible phytochelatin and its involvement in Cd-tolerance in cauliflower. To develop heavy metal-tolerant transgenic plants, we ligated the structural gene of yeast metallothionein gene (CUP1) downstream of CaMV35S promoter and introduced the fused gene into cauliflower. A Cd-tolerant transgenic cauliflower was selected, which grew well in the presence of 400 µM or less Cd, whereas the non-transformed cauliflower tolerated only up to 25 µM Cd. The transgenic cauliflower accumulated more Cd, especially in the upper leaves, than the non-transformed plant.In conclusion, by transfer of the yeast metallothionein gene into cauliflower increased Cd-tolerance and Cd-accumulating ability can be conferred to the plant.     

An Insect-Resistant Transgenic Cabbage Plant with Cowpea Trypsin Inhibitor(CpTI) Gene

Cowpea trypsin inhibitor (CpTI) gene was transformed into Brassica oleracea var. capitara variety "Yingchun" and "Jingfeng" mediated by the Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pRCL27). Transgenic plants were obtained from transformed calli or explants. It was shown from the ELISA assay that NPT Ⅱgene was expressed in the transgenic cabbage cells. The integration of the CpTI gene into cabbage genome DNA was confirmed by Southem blotting. Insect-tolerance of the transgenic plants to Pieris rapae L. was observed by bioassays on the transgenic plants in the laboratory.     

雄性不育相关基因msLTP的反义RNA验证

根据普通白菜雄性不育相关的脂质转移蛋白基因(msLTP)的cDNA序列设计引物,从普通白菜花蕾的cDNA中扩增出312bp的片段,然后将该片段连接至双元载体pBI12l中,得到反义RNA植物表达载体并导入农杆菌LBA4404菌株中,通过农杆菌介导法转化菜心;利用PCR和Southern blot分析检测得到了25株转基因植株,转基因植株的花粉部分畸形或空瘪,花粉离体萌发率为38.56%,较未转化植株的萌发率(76.32%)降低了37.76个百分点.研究表明,反义RNA技术使msLTP基因沉默而导致了菜心转基因植株的部分花粉发育不良,说明msLTP基因在普通白菜和菜心等花粉发育中具有重要作用.