长枝木霉eg1基因的克隆及表达

从长枝木霉3.1029基因组中克隆了内切葡聚糖酶EGI基因,该基因全长1 566 bp,由3个外显子2个内含子组成,编码461个氨基酸,编码蛋白的N端为22aa组成的信号肽。采用重叠PCR法获得无内含子的内切葡聚糖酶基因eg1,构建成pYE-Leg1重组质粒;同时将其成熟肽编码序列插入酿酒酵母分泌型表达载体pYEα中,构建成pYEα-Leg1重组质粒;分别转化酿酒酵母。重组转化子经β-半乳糖诱导,检测表达产物的酶活,结果表明,pYE-Leg1转化子无明显胞外酶活;而pYEα-Leg1转化子在刚果红平板上可产生明显的水解圈,酶活检测显示pYEα载体可有效地将该基因在酿酒酵母中表达并分泌到胞外,发酵液中的酶活在培养96 h达到最高1.16 U/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为5.6。以上研究将为利用酿酒酵母生产胞外纤维素酶提供依据。     

拟康氏木霉eg1基因的克隆及在酿酒酵母中的分泌表达

从拟康氏木霉3.3002基因组中克隆了内切葡聚糖酶EGI基因,该基因全长1566 bp,由3个外显子2个内含子组成,编码461个氨基酸.编码蛋白EGI的N端为22aa组成的信号肽,其后依次为催化结构域、连接肽和结合结构域.采用重叠PCR法获得无内含子的内切葡聚糖酶基因eg1,并将其成熟肽编码序列插入酿酒酵母分泌型表达载...     

玉米△12脂肪酸脱氢酶基因（FAD2）在酿酒酵母中的表达

玉米△12脂肪酸脱氢酶是催化油酸形成亚油酸的关键酶。将其编码基因FAD2（GenBank登陆号：DQ496227）克隆到酿酒酵母表达载体pYES2．0中,构建成重组质粒pYE／FAD2,转化到酿酒酵母进行诱导表达,同时以pYES2．0转化子为对照。气相色谱（Gc）分析表明,重组转化子亚油酸的含量占酵母总脂肪酸的1．54％,而对照未检测到亚油酸。表明FAD2基因具有编码△12脂肪酸脱氢酶的功能。为探索转译起始密码子周边序列的改变对FAD2基因表达产生的影响,将该基因的起始密码子上游序列进行修改,构建重组表达载体pYE／FAD2—1,转化酿酒酵母进行表达。GC分析表明,pYE／FAD2—1转化子的亚油酸含量占总脂肪酸含量的8．81％,是对照pYE／FAD2转化子的近5倍。     

瑞氏木霉EG I 3＇-UTR 对基因在酿酒酵母中表达的影响

将纤维素降解菌丝状真菌瑞氏木霉内切葡聚糖酶I(EGI)全长cDNA克隆于酿酒酵母H158中得到表达.重组酿酒酵母产生的EG Ⅰ的最适pH值为5.0,最适作用温度为50℃～60℃.EGI cDNA中的3＇-非翻译区(3＇-UTR)序列的删除导致EGI基因在酵母菌中没有活性产物表达.通过RT-PCR技术检测EGI mRNA转录水平的结果表明,带有3＇-UTR的EG[cDNA在酿酒酵母中具有明显的转录产物生成,但删除3＇-UTR之后的EG I cDNA却检测不到转录产物.这说明EG Ⅰ的3＇-UTR对基因在酵母菌中的表达具有重要作用.     

白蚁内切-β—1，4-葡聚糖酶基因的克隆、表达、纯化及酶学性质的研究

提取了台湾家白蚁总RNA并反转录获得eDNA,PCR扩增出白蚁内切葡聚糖酶的基因,并将目的基因分别克隆到大肠杆菌和酿酒酵母载体中,构建了产内切-β-1,4-葡聚糖酶的基因工程菌。由于大肠杆菌会有少量的泄漏表达,而所用的酿酒酵母表达载体是本实验室构建带有INU信号肽的表达载体,故都可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶（CMCase）活性的重组转化子。利用金属镍亲和层析对大肠杆菌表达的内切-β-1,4-葡聚糖酶进行纯化,CMC酶活检测显示纯化酶的最适温度和最适pH值分别为42℃、6．5;内切-β-1,4-葡聚糖酶的Vmax为0．071mg／mL·min,Km值为80．2712mg／mL。     

Secreted expression of the pullulanase in Bacillus amyloliquefaciens BF7658

根据文献报道的核苷酸序列合成Bacillus deramificans普鲁兰酶成熟肽编码基因BdP.将BdP基因插入芽孢杆菌分泌表达载体pUC980信号肽编码区下游,获得重组质粒pUC980-BdP,重组质粒转化中温α-淀粉酶生产菌解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株.摇瓶发酵实验表明,重组转化子发酵液有明显普鲁兰酶酶活,约48 h酶活达到最高水平,为2.8 ASPU/mL.酶学性质分析表明,重组酶最适作用温度约为60℃,最适反应pH为5.0,60℃保温3h仍保存50％的活性.重组酶性质适合淀粉糖化工艺的要求.     

虹鳟肿瘤坏死因子(TNFα)基因体外表达与纯化的研究

将虹鳟两种肿瘤坏死因子TNFα和TNFα2基因的成熟肽编码区域,用带有BamHI和HindⅢ酶切位点的基因特异性引物进行：PCR扩增。扩增片段用限制性内切酶消化并连接到pQE30表达载体上,连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细菌中。转化子经PCR筛选,质粒测序,完成了虹鳟两种TNFα基因重组子的构建。重组子经体外培养和诱导后,获得了高效表达的TNFα重组蛋白。高效表达的重组TNFα不受诱导剂IPTG的影响,并且由于重组子高效表达而形成了包涵体;重组蛋白产量约占菌体蛋白总量的25％—30％。应用Ni-NTA和固定金属亲和层析(IM-PC)技术,在变性条件下获得了高度纯化的重组蛋白,纯化重组蛋白的产量约为0．5—1mg／L。     

核盘菌arom基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)arom基因已经被克隆、测序。该基因编码的AROM蛋白是芳香族氨基酸合成途径中催化第二步到第六步的五功能多肽。为了对扩增的核盘菌arom基因进行功能验证和探索大量获得AROM蛋白的成熟方法,克隆了arom基因的编码框序列,并将其与载体pYES2连接,构建了酵母表达载体pYES2-arom。用LiAc/SSDNA/PEG方法将该表达载体转入酿酒酵母H158(Saccharomyces cerevisiaeH158)中。酶活测定、RT-PCR和Northern杂交结果显示,核盘菌arom基因在酿酒酵母胞内获得了表达,转化子具有AROM蛋白结构域之一5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的催化活性。不同培养时间取样样品的酶活检测结果表明,当转化子在30℃的条件下,在SC-U酵母尿嘧啶营养缺陷型选择培养基中以180r/min被振荡培养时,其外源AROM蛋白的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶酶活在培养72h达到最高。     

细菌的β-1,4一内切葡聚糖酶基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达

将大肠杆菌质粒pA2含气单孢菌（Aromonds.sp.212）的β-1,4-内切葡聚糖酶基因直接连干大肠杆菌／酵母菌穿梭载体pVC727组建成重组质粒,质粒PVC含强启动子。首先,通过菌落染色方法和Congo－Red染色方法筛选到大肠杆菌DH5α转化子,然后以重组质粒转化酿酒酵母BJ1991并得到表达。最后,对酶反应的最适pH和适宜温度进行了测定。     

人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人血清白蛋白(HSA)-C肽(CP)融合蛋白的毕赤酵母表达菌株.方法根据表达系统的密码子偏好性优化CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1 800bp)和CP(100bp)基因,将HSA-CP融合基因双酶切后插入分泌表达栽体pPIC9K中,重组质粒pPIC9K-HSA-CP经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut 转化子.PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达.结果融合基因约为1 900bp,序列测定正确.SDS-PAGE分析表明表达融合蛋白的相对分子量约为70kD,摇瓶培养表达量为140mg/L,Western blot鉴定显示表达的融合蛋白为HSA和CP的杂合分子.结论实现了HSA-CP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,细胞活性研究显示HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用.