cDNA微阵列制作的优化

为了优化筛检cDNA微阵列中靶基因的最适长度、浓度及点样溶液的种类,设计持家基因betaactin和GAPDHRT PCR3对引物,产物长度在189～1078bp之间,以乙肝病毒DNA片段为阴性对照,扩增纯化后分别溶于3×SSC、50%DMSO及0.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH=9.0)中,调整浓度分别为0.5μg/μL、1.0μg/μL和1.5μg/μL,比较上述不同条件的杂交结果。结果表明,杂交具有较好的特异性,阴性对照(乙肝病毒)和空白对照(点样溶液)均未见杂交信号;3种长度的同一靶基因杂交信号强度无明显差别(betaactinP=0.378;GAPDHP=0.866);3种点样溶液中以50%DMSO杂交信号最好,较强且均匀一致(P=0.0001),其余2种差异不显著(P=0.142);3种浓度靶基因杂交信号差异不显著(P=0.648),浓度高者信号略强。短片段靶基因(200bp左右)可获得与长片段靶基因(1000bp以上)一样较好的杂交信号,点样溶液以50%DMSO效果最好,靶基因浓度为0.5μg/μL时即可得到较好的杂交结果。     

cDNA微阵列制作的优化

为了优化筛检cDNA微阵列中靶基因的最适长度、浓度及点样溶液的种类,设计持家基因beta actin和GAPDH RT-PCR 3对引物,产物长度在189～1 078 bp之间,以乙肝病毒DNA片段为阴性对照,扩增纯化后分别溶于3×SSC、50%DMSO及0.5mol/L碳酸盐缓冲液（pH=9.0）中,调整浓度分别为0.5μg/μL、1.0μg/μL和1.5μg/μL,比较上述不同条件的杂交结果。结果表明,杂交具有较好的特异性,阴性对照（乙肝病毒）和空白对照（点样溶液）均未见杂交信号;3种长度的同一靶基因杂交信号强度无明显差别（beta actin P=0.378;GAPDH P=0.866）;3种点样溶液中以50%DMSO杂交信号最好,较强且均匀一致(P=0.0001),其余2种差异不显著(P=0.142);3种浓度靶基因杂交信号差异不显著(P=0.648),浓度高者信号略强。短片段靶基因（200 bp左右）可获得与长片段靶基因（1 000 bp以上）一样较好的杂交信号,点样溶液以50%DMSO效果最好,靶基因浓度为0.5μg/μL时即可得到较好的杂交结果。 Abstract:To optimize and screen the most suitable target gene length,concentration and printing solution in cDNA microarray,housekeeping genes,such as beta actin and GAPDH,were selected as targets and hepatitis B virus gene as negative control.The RT-PCR primers that spanned at least one intron and whose products were at between 189 bp and 1 078 bp were designed with primer premier 5.0,so did the hepatitis B virus gene PCR primer.After polymerase chain reaction,the products were purified with ethanol and dissolved in 3×SSC,50% DMSO and 0.5mol/L carbonate buffer（pH=9.0）respectively.The concentrations of target genes were adjusted at 0.5μg/μL,1.0μg/μL and 1.5μg/μL.The hybridization signals had a good specificity.No signal showed in either negative control (HBV) or blank control (printing solution only).There was no significant difference in target gene lengths.The P value of beta actin (189 bp,491 bp,974 bp) and GAPDH (227 bp,552 bp,1 078 bp) was 0.378 and 0.866 respectively.There was no significant difference among concentrations（P=0.648）,too.However,the higher the concentration was,the stronger the signals would be.Among the three kinds of printing solution,50% DMSO was the best（P=0.0001）,while the other two had no difference by multi-comparison(P=0.142).The target gene at length between 200 bp and 1 000 bp has got the same hybridization signals.50%DMSO printing solution and the target gene concentration of 0.5μg/μl are suitable for good hybridization.     

应用cDNA微阵列研究肿瘤基因表达谱

随着研究水平的深入 ,对基因在发育过程中、生理反应中和疾病发展中表达上的时空差别 ,基因蛋白质产物的亚细胞定位和细胞分子间的相互作用等研究领域的开拓 ,所涉及到的基因的广泛性用传统方法研究已很难达到要求 ,因此一些新的研究方法应运而生 ,基因表达谱的研究即为其中之一。基因表达谱 ( ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ)是指细胞中所有基因表达的格局 ,具体说来就是指细胞中产生所有ｍＲＮＡ的总和。对于所有的ｍＲＮＡ来说 ,通常采用的研究方法是将其逆转录成ｃＤＮＡ ,通过构建ｃＤＮＡ文库 ,再进行分析研究。原先采用…     

cDNA微阵列与寡核苷酸芯片的制备方法

cDNA微阵列和寡核苷酸芯片是常见的合成后点样的DNA微阵列。点样方法主要是通过物理吸附或共价结合的方式将探针固定于载体上,本总结了近年来国内外献报道的cDNA微阵列制备方法;在多聚赖氨酸包被的玻璃基片表面制备cDNA微阵列;用琼脂糖包被的玻璃基片制备cDNA微阵列;在氨基或醛基修饰的玻璃基片表面制备cDNA微阵列;寡核苷酸芯片的制备方法;氨基修饰的玻片与5′末端带氨基的寡核苷酸探针通过不同的linker连接;硅烷化寡核苷酸直接点样于玻片上制成寡核苷酸微阵列;硫代寡核苷酸通过二硫键与巯基修饰的玻片连接;水凝胶芯片固定寡核苷酸。丙烯酰胺硅烷化的基片与5′丙烯酰胺修饰的寡核苷酸连接。并展望了基因芯片的应用前景。     

蛋白质微阵列生产用琼脂糖修饰玻片制备的条件优化

目的:建立一种以琼脂糖修饰的玻片为载体的蛋白质微阵列制备的优化方法,比较琼脂糖修饰玻片和醛基修饰玻片及氨基修饰玻片对蛋白质固定效率的优劣。方法:将羊IgG固定在载体表面,经过洗涤、封闭,再加入Cy3标记的兔抗羊IgG,孵育,洗涤后用共聚焦激光扫描仪获取图像,检测各点的荧光强度,根据荧光强度确定最佳琼脂糖浓度,最佳NaIO4浓度,最佳固定时间以及封闭时间等实验条件。结果:琼脂糖浓度为1.2％、NaIO4浓度为20mmol／L、固定时间为1h、孵育时间为45min时,蛋白质在载体上的固定效率和反应活性最高。在固定的抗体浓度相同的情况下,琼脂糖修饰玻片荧光强度是醛基修饰玻片的2.6倍,是氨基修饰玻片的9倍。结论:确立了蛋白质微阵列生产用琼脂糖修饰玻片制备的优化条件,用该优化条件制备的琼脂糖玻片更适合用于蛋白质微阵列载体。     

cDNA微阵列在功能基因组学研究中的应用

cDNA微阵列是当前功能基因组学研究中的一种强有力的工具。由于微阵列能检测全基因组水平上的基因表达,它能帮助人们把研究对象作为一个整体进行研究。这正是以往孤立地研究特定基因的研究方式所不能比拟的。本文简要介绍了cDNA微阵列技术的发展渊源和大致的操作流程,侧重于原理和策略,突出了它与传统方法在思路上的不同之处,同时也分析了它目前的瓶颈和局限。最后,展望了其进一步发展的方向。     

cDNA微阵列技术在植物功能基因组学研究中的应用

cDNA微阵列 (cDNAMicroarrays)技术是近年发展起来的分子生物学研究新型工具 ,以分子杂交为基本原理 ,在检测植物基因表达水平、研究基因表达图谱、特异基因检测以及发现新基因和分离差异表达基因等方面有着独特的优势 ,已成为植物功能基因组学研究的重要手段。     

cDNA微阵列技术研究NaHCO3胁迫下星星草基因表达谱

为研究NaHCO3胁迫下星星草基因的表达,分别将荧光染料Cy5-dCTP和Cy3-dCTP用反转录方法标记在处理和对照星星草cDNA上制成探针,并与载有星星草基因的cDNA芯片进行杂交。通过对芯片的杂交信号强度分析来研究基因的表达情况。分析结果显示,共有25个基因在NaHCO3胁迫处理前后差异表达,其中17个基因在NaHCO3胁迫下表达下调,8个基因在NaHCO3胁迫下表达上调。生物信息学分析表明这些基因的功能涉及了信号传导与转录调控、细胞防御、细胞代谢等多个方面。从而获得了NaHCO3胁迫下星星草的基因表达谱,定量地阐述了NaHCO3胁迫和非胁迫条件下星星草基因的差异表达情况。     

应用cDNA微阵列技术筛选大鼠脊髓损伤修复相关基因

脊髓损伤是一类常见的、高致残率的中枢神经系统疾病,由于多种复杂因素影响其损伤后的修复过程,损伤脊髓的再生能力非常有限。本研究采用cDNA微阵列技术筛选大鼠脊髓损伤后出现的差异表达基因。实验组动物在T8-T9进行脊髓全横断手术,对照组动物只打开椎板;4．5d后取脊髓进行RNA提取并在反转录过程中进行Cy3／Cy5标记,然后与预制的、带有4041条特异性探针的芯片进行杂交。Cy5／Cy3信号比值≥2．0视为脊髓损伤后出现差异表达的基因。通过筛选,我们得到了65个上调表达基因（21个已知基因,30个已知EST和14个未知基因）和79个下调基因（20个已知基因,42个已知EST和17个未知基因）。进一步通过半定量RT-PCR对其中的5个上调已知基因（Timpl,Tagln,Vim,Fc gamma receptor,Ctss）和三个下调已知基因（stearyl-CoA desaturase,F2,Ensa）的表达情况进行了验证,结果显示与芯片结果一致。这些基因可能在脊髓损伤后的修复过程中起一定的作用,对其深入研究将有助于揭示脊髓损伤修复的分子机制。     

用cDNA微阵列技术快速筛选粗毛栓菌的表达基因

利用cDNA微阵列技术快速筛选具有较强降解木质纤维素能力的白腐真菌粗毛栓菌(Trametes gallica)的表达基因.利用木质素生物降解模式菌株黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的cDNA制备研究所用微阵列.在含有2 596个cDNA片段的芯片上共检测到172个阳性克隆,其中有165个克隆的荧光信号比值(Cy-5/Cy-3)在0.5和2.0之间,占所检测阳性克隆数的95.9%.对应于在限氮条件下生长5天和12天的粗毛栓菌培养物,分别有3个和4个时序特异性差异表达基因.随机挑取122个克隆进行测序和序列比对,发现所测序列中有118个能够很好地定位于黄孢原毛平革菌的基因组上.结果显示,粗毛栓菌与黄孢原毛平革菌在表达序列上存在较大差异,表明这两种真菌之间存在着较远的亲缘关系.通过同源性比对分析,发现2个令人感兴趣的克隆,一个对应于黄孢原毛平革菌过氧化物酶基因lpoB的部分片段,另一个为编码一种热激蛋白的基因.     

机械点样DNA微点阵技术及其在基因表达分析上的应用(I)

从芯片制作、芯片杂交、芯片扫读与图像分析、基因表达数据分析等方面,详细介绍了机械点样DNA微点阵技术及其应用于多基因表达分析的基本步骤与原理。     

DNA微阵列基片的化学处理

对于合成后点样的DNA微阵列 ,基片的表面化学处理非常重要。它直接影响到样品与基片的结合效率 ,进而影响杂交结果。基片表面的各种化学修饰方法多种多样 ,物理吸附主要以赖氨酸包被为主。共价结合通常使用同源偶联分子或异源偶联分子 ,还可以在基片表面组装线状、分支状连接分子或包被琼脂糖。着重介绍了DNA微阵列的制备 ,即样品如何固定到玻璃基片上。总结了不同类型基片表面的化学修饰方法以及DNA与基片的化学结合。     

Stabilization of the immobilized linkers and DNA probes for DNA microarray fabrication by end-capping of the remaining unreacted silanol on the glass

High stability of the oligonucleotides immobilized on the glass is essential for the reliable DNA microarray analysis. In the present study, effect of end-capping of the unreacted silanol, remaining after the surface amine-functionalization, was explored: (1) Cy3-NHS (N-hydorxysuccinincimide) dye was spotted on the surface and change in the fluorescent intensity was measured. (2) DNA probes were immobilized by the reactivity of oxanine linked at the 5’-end, the complementary oligonucleotides with Cy5-fluorescence at the 5’-end was hybridized, and the time-dependence of the fluorescence intensity was observed. Both the systems showed improved stability of the immobilized molecules, indicative of the stabilization by end-capping.     

Complementary DNA libraries

The generation of complete and full-length cDNA libraries for potential functional assays of specific gene sequences is essential for most molecules in biotechnology and biomedical research. The field of cDNA library generation has changed rapidly in the past 10 yr. This review presents an overview of the method available for the basic information of generating cDNA libraries, including the definition of the cDNA library, different kinds of cDNA libraries, difference between methods for cDNA library generation using conventional approaches and a novel strategy, and the quality of cDNA libraries. It is anticipated that the high-quality cDNA libraries so generated would facilitate studies involving genechips and the microarray, differential display, subtractive hybridization, gene cloning, and peptide library generation.     

用于寡核苷酸芯片制备载体的醛基载玻片的制备方法优化及性质研究

优化了醛基载玻片的制备方法 ,探讨了醛基修饰载玻片固定寡核苷酸探针的性质。研究发现氨基硅烷试剂的浓度是影响载玻片荧光背景的主要因素 ;2 %氨基化试剂处理 16min、戊二醛处理 30min可以得到荧光背景较低、固定效果较好的醛基载玻片。寡核苷酸固定过程中 ,末端氨基修饰没有明显的特异性 ,但是可以提高被固定探针的杂交容量。在较低的浓度 (小于 10 μmol L)时 ,探针的浓度与杂交信号趋近线性关系 ,浓度为 2 0 μmol L时杂交信号达到饱和     

质粒DNA抗原芯片检测抗双链DNA抗体的初步研究

目的:建立以质粒DNA作为抗原的检测血清中抗双链DNA(dsDNA)抗体的芯片方法,并与酶联免疫吸附实验比较,初步探讨用芯片法检测抗dsDNA抗体的临床价值。方法:将原核表达载体质粒pcDNAⅡ用质粒DNA快速抽提试剂盒提取纯化DNA后按1∶2稀释,用点样仪点在经3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)修饰的玻片上,温孵后用含有1%小牛血清白蛋白和2.5%蔗糖的PBST封闭,以Cy3标记的人IgG为二抗,建立检测dsDNA抗体的芯片方法,并与德国欧蒙公司生产的抗双链DNA检测ELISA试剂盒做比较,对包括58例系统性红斑狼疮(SLE)、25例干燥综合征(SS)、10例皮肌炎(DM)和7例类风湿关节炎(RA)在内的病人和60例健康人对照进行了抗dsDNA的对比检测。结果:对阳性标本的检测,与现用常规检测方法ELISA相比,芯片检测抗dsDNA的灵敏度为91.3%,特异度为90.7%,阳性预测值为89.3%,阴性预测值为92.5%;对健康对照的检测,2种方法均为阴性,符合率为100%。结论:与ELISA相比,用质粒DNA作为抗原建立的芯片方法的灵敏度和特异度较高,为今后建立同时检测多个自身抗体的芯片奠定了基础。