Smad3基因剔除的骨髓细胞移植对小鼠的影响

目的通过小鼠骨髓细胞剔除Smad3基因,观察小鼠病理变化以及免疫T细胞状态。方法将Smad3基因剔除Smad3-/-)的小鼠骨髓细胞和野生型(Smad3+/+)小鼠骨髓细胞分别移植给60Co射线照射GFP小鼠。观察骨髓移植后GFP小鼠体征变化,第6周处死小鼠,取肠道固定,HE染色观察其病理变化,流式细胞技术检测淋巴结中T细胞变化。结果移植Smad3-/-骨髓细胞的GFP小鼠逐渐消瘦,大肠出现炎症;淋巴结中活化型的CD4+CD62LloT细胞增多。结论骨髓细胞TGF-β信号受阻,可导致小鼠患炎症疾病,引起免疫T细胞活化。     

用cDNA微阵列研究辐射损伤小鼠髓细胞基因的表达

为了探讨辐射引起小鼠髓细胞损伤后基因表达的变化,运用常规分子生物学和cDNA微阵列杂交技术,观察小鼠肥大剂量射线全身一次性照射后,骨髓细胞中588种已知功能基因的表达情况,初步得到辐射损伤后骨髓细胞某些功能基因的差异表达变化谱,结果表明,辐射可诱导小鼠骨髓细胞中一系列基因表达变化,这些基因可能参与了辐射所致骨髓细胞损伤的过程。     

Exo-1基因对端粒酶缺陷小鼠造血干细胞植入效率的影响

目的利用不同的造血干细胞移植方式,探讨Exo-1基因缺失对端粒酶基因敲除小鼠的造血干细胞植入效率的影响。方法以CD45.1小鼠的骨髓细胞或骨髓造血干细胞为供体,以端粒酶基因敲除小鼠或Exo-1基因和端粒酶基因双敲除小鼠为受体,在给予不同剂量X线照射或不照射的情况下,重复进行静脉注射全骨髓细胞或分选的骨髓造血干细胞(c-kit+、Sca-1+、lineage-,KSL),于移植后1个月取外周血,流式分析嵌合率。结果未经X线照射及1 Gy、2 Gy照射情况下,端粒酶基因缺陷受体小鼠的外周血中供体来源的细胞嵌合率较低;6 Gy照射后,供体来源的外周血细胞嵌合率仍低于50%,而且端粒酶基因缺陷受体小鼠在移植后1个月内死亡较多;3 Gy照射可形成较高嵌合率,Exo-1基因缺失对端粒酶缺陷小鼠的造血干细胞植入效率的影响不显著。结论以端粒酶缺陷小鼠作为衰老模型研究造血干细胞植入效率时,3 Gy X线照射能够有效地形成较高的外周血供体细胞的嵌合率,但是Exo-1基因没有进一步提高造血干细胞在端粒酶敲除小鼠的植入效率。     

小鼠低剂量辐射损伤模型的初步研究

目的:对小鼠低剂量辐射损伤模型进行初步研究并筛选敏感检测指标.方法:实验分7组,1组为正常组,其余6组用XHA600直线加速器射线照射,每组取一部分小鼠于照射后2、4、8、16h测定红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)和血红蛋白(HGB)含量;测定小鼠肝脏和脾脏重量及其组织中的超氧化合物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量;剩余小鼠于4周后观察骨髓切片中血细胞变化.结果:照射后4h测定血常规,发现累积辐射0.4Gy组小鼠RBC有降低趋势,WBC、HGB显著降低,PLT显著升高;肝脏、脾脏的湿质量显著降低;小鼠肝脏组织中MDA的含量显著升高、SOD的活力显著降低;4周后小鼠骨髓细胞的病理改变与单次照射剂量相关,单次较大剂量(如0.6Gy)照射对骨髓细胞影响较大,在4周观察期不能自身恢复,而多次累积照射对骨髓细胞病理改变较小.结论:小鼠低剂量辐射损伤模型的最佳造模剂量为累积照射0.4Gy即每次照射100mGy,间隔一天,连续照射4次.     

应用绿色荧光蛋白研究外源基因在造血细胞的表达调控

以增强型绿色荧光蛋白为报道分子,研究双基因逆转录病毒载体介导小鼠骨髓细胞的基因转移中,SV(simianvirus)40启动子和内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)对双基因共表达的影响。构建双基因中间序列分别为SV40启动子和IRES的载体pLESN和pLEIN。经包装获得较高滴度的病毒上清,以共培养的方式感染5-氟尿嘧啶预刺激的小鼠骨髓细胞。流式细胞仪检测表明转染效率约25%,PCR证明EGFP基因整合至骨髓细胞基因组。半固体培养转基因细胞7d,LEIN组获得具有G418抗性的集落中98%表达绿色荧光,而LESN组54%。结果表明:在双基因逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓细胞的基因转导中,IRES与内部SV40启动子相比,更能保证双基因的共同表达。     

大豆异黄酮对辐射小鼠造血系统损伤防护作用的实验研究

研究大豆异黄酮(SoybeanIsoflavone,SI)对辐射损伤小鼠造血系统功能的影响。雄性昆明小鼠照射前补充SI,经4Gyγ射线照射,观察补充SI对电离辐射损伤小鼠内源性脾结节(CFU-S)数、骨髓细胞粒、巨噬系细胞集落形成单位(CFU-GM)数、骨髓细胞DNA含量及外周血淋巴细胞DNA损伤程度的影响。结果显示SI提高了辐射损伤小鼠CFU-S数,增加了骨髓有核细胞CFU-GM数,降低外周血淋巴细胞DNA损伤程度,对骨髓细胞DNA含量也有一定的增加趋势。表明SI可以提高辐射损伤小鼠造血干祖细胞的增殖能力,减轻辐射对骨髓细胞和外周血淋巴细胞DNA的损害,SI对辐射小鼠的造血系统有一定的防护作用。     

HAPO促进放射损伤小鼠的造血重建

目的 明确人促血液血管细胞生成素 (HAPO)对骨髓抑制小鼠的造血重建作用。方法 研究HAPO、G-CSF对骨髓抑制小鼠的促造血作用,以700 cGy 137Csγ射线全身照射的Balb/c小鼠为模型,观察照射后小鼠的生存率;检查血常规;计数内源性脾结节;计数骨髓细胞数;采用半固体培养基进行集落培养检测骨髓细胞的高增殖潜能;取小鼠骨髓细胞接种于96孔培养板,分别在照射前或照射后加HAPO、G-CSF培养72hr,MTT方法测定活细胞数;取小鼠骨髓细胞,分别在照射后加HAPO,培养3周后观察各组小鼠骨髓细胞的生长情况。结果 HAPO、G-CSF均可明显提高放射后的小鼠的生存率;使内源性的脾集落增加。照射后的各组小鼠外周血白细胞变化较为明显,HAPO组白细胞恢复快于PBS组,也可高于G-CSF组。各组小鼠骨髓细胞数虽然14天时G-CSF组最为明显,但32天时HAPO组骨髓细胞数超过G-CSF组,至42天时基本恢复正常;而G-CSF组在32天、42天时骨髓细胞数仍低于正常值。在7天、14天、32天时取各组小鼠骨髓细胞高增殖潜能检测试验,HAPO组生成的GEMM-CFU数均最多。在照射前与HAPO、G-CSF孵育的骨髓细胞,HAPO组活细胞数量比对照组明显增高,而G-CSF组与对照组无明显差异。骨髓细胞被照射后培养72hr时,MTT测定显示不同剂量HAPO、G-CSF均能促进放射后骨髓细胞的增殖。骨髓细胞被照射后继续培养3周,HAPO组均有造血岛生成,细胞sca-1、CD31呈阳性,周围CD31阳性的内皮细胞增多。而PBS组则未出现造血岛,基质细胞中极少有CD31阳性细胞的内皮细胞,未发现sca-1阳性细胞。结论 体内、外实验表明,人促血液血管细胞生成素HAPO对放射损伤的Balb/c小鼠有明显的促造血重建作用,提高小鼠的生存率,促进其造血干细胞的增殖与生长。     

辐射对小鼠骨髓细胞膜β-肾上腺素能受体的影响

本文以测定 cAMP 含量为手段,研究了~(60)Co-γ下线800 R 照射及合并β-肾上腺素能刺激剂对小鼠骨髓细胞膜上β-肾上腺素能受体的反应。β-肾上腺素能刺激剂可通过对β-肾上腺能受体作用而引起骨髓细胞内 cAMP 含量改变;照射和异丙基肾上腺素(IPR)均可使 cAMP含量增加,照射以后再注入 IRP 则 cAMP 含量增加的幅度超过单纯照射和 IPR,然而,IPR注入后再照射,cAMP 含量不增加。心得安(PPL)可有效地阻断由照射或 IPR 引起 cAMP升高的反应。     

低水平辐射诱导的细胞遗传学适应性反应

先用0.01GY x-射线(剂量率:0.01GY/分)体外照射人、兔外周血,经不同时间后再用1.5GY X-射线(0.44GY/分)照射,发现在G_0、G_1、S和G_2期受0.01GY X-射线照射后再给大剂量照射者,其染色体畸变率明显低于单纯受1.5GY X-射线照射组(P<0.01)。这一适应性反应能持续3个细胞周期,在接受小剂量照射后超过3个细胞周期再受大剂量照射者,染色体畸变率未见减少。若在第三细胞周期以后再次给予小剂量照射,可再次诱导适应性反应。用小鼠整体小剂量照射后骨髓细胞和生殖细胞亦出现这种适应性反应。另外也探讨了不同剂量和不同剂量率的预先照射对适应性反应的影响。     

p18INK4C基因缺失增强造血干细胞在亚致死剂量照射小鼠体内长期植入能力

观察p18INK4C(p18)基因缺失对造血干细胞(HSC)在亚致死剂量照射小鼠体内长期植入的影响. 供体为p18基因缺失型(p18(/()纯系C57BL/6小鼠(CD45.2表型), 竞争性细胞来源于C57BL/6-Ly5.1(CD45.1/2)双表型小鼠, 受体为野生型(p18+/+)C57BL/6-Ly5.1(CD45.1)小鼠. 竞争性骨髓移植(cBMT)实验根据受体小鼠照射剂量的不同分为3个剂量组(10 Gy, 5 Gy和1 Gy). 供体细胞和竞争性细胞1:1混合后移植, 移植后采集外周血和骨髓细胞用流式细胞仪检测各细胞比例. 造血恢复移植实验: 移植后检测外周血白细胞计数评价移植后造血恢复速度. 10和5 Gy照射剂量组, 供体细胞和竞争性细胞成功植入, 而1 Gy照射剂量组无供体细胞植入. 无论在10 Gy或是5 Gy照射剂量情况下, 供体细胞在受体内的比例均高于竞争性细胞. 移植后6周, 10和5 Gy照射剂量时外周血中供体细胞比例分别为竞争性细胞的1.46±0.21倍和1.64±0.43倍, 14周时分别为竞争性细胞的1.84±0.25倍和2.00±0.49倍, 26周时分别为竞争性细胞的3.13±0.79倍和3.24±1.33倍. 移植后6个月, 10 Gy照射剂量时骨髓细胞中供体细胞比例为竞争性细胞的7.68±4.42倍, 5 Gy照射剂量时为竞争性细胞的10.83±2.98倍. 移植后6个月, 在10和5 Gy照射剂量组之间骨髓中造血细胞植入率相当, 分别为(85.53±8.71)%和(80.87±2.87)% (P = 0.457). p18(/(细胞与p18+/+细胞相比, 移植后造血恢复的速度相当. p18基因缺失可以显著增强HSC在亚致死剂量照射小鼠体内的长期植入能力.     

A型流感病毒NS1基因密码子去优化改造引起病毒毒力减弱

根据A型流感病毒密码子使用偏嗜性,选取稀有密码子对A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒NS1基因内部110个氨基酸区域进行密码子同义突变改造,并全基因合成NS基因,利用反向遗传操作技术拯救出含有密码子去优化NS1基因的重组病毒(deoNS)。体外细胞噬斑形成实验和病毒生长曲线证明该病毒在MDCK细胞内的感染和复制能力比野生型病毒低约1000倍;BALB/c小鼠体内致病力实验证明deoNS病毒不能引起小鼠发病和死亡,该病毒在小鼠肺内的复制滴度比野生型病毒低100～1000倍。本研究探索了通过基因组密码子去优化改造途径降低A型流感病毒毒力的可行性,首次证明流感病毒NS1基因密码子去优化同义突变可以降低病毒毒力,为流感减毒活疫苗的研究提供了新的思路。     

转基因动物研究现状

导言 1980年Gordon等人将疱疹病毒胸苷激酶基因和SV40早期基因启动子重组到质粒pBR322中,再由显微注射植入小鼠受精卵原核,获得第一只转基因小鼠。原理上任何克隆基因都能永久并入哺乳动物胚胎基因组。显微注射后,外源DNA整合进细胞,随后繁衍成种系。因此通过选育能永久建立携带一个或多个新基因的动物谱系。“转基因”(Transgenic)一词应运而生。在此之前,Jaenisch(1976)观察到逆转录病毒(又称逆病毒)感染小鼠胚胎,使单个前病毒DNA插入小鼠染色体DNA。而后含异源基因的重组感染性逆病毒系统的发展导致了用     

载氢-纳米氧化铈微泡对小鼠造血系统抗辐射作用的分析

为探讨载氢-纳米氧化铈微泡对小鼠辐射损伤的防护作用。本研究检测载氢-纳米氧化铈微泡的表征,并将60只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、照射对照组、载氢-纳米氧化铈微泡组。小鼠经6Gy x射线一次性全身照射(剂量率2 Gy/min)。于照射后3 d和8 d处死小鼠,检测其外周血细胞数、脾脏和胸腺指数、骨髓和脾脏组织病理学变化。结果显示,照射后3 d和8 d,与正常对照组相比,载氢-纳米氧化铈微泡组和照射对照组的白细胞均明显下降,相比照射对照组,载氢-纳米氧化铈微泡组有改善(p<0.05或p<0.01);而载氢-纳米氧化铈微泡组和照射对照组的红细胞数和血红蛋白均略有下降,但差异无统计学意义。与正常对照组相比,微泡组的胸腺指数、脾脏指数均有下降,和照射对照组相比,载氢-纳米氧化铈微泡组的胸腺指数明显改善(p<0.05或p<0.01)。照射后3 d,与正常对照组相比,照射对照组的骨髓细胞较少,存在细胞碎片,载氢-纳米氧化铈微泡组骨髓细胞数量略有减少,存在细胞核松散现象。而照射后8 d,与正常对照组相比,照射对照组的骨髓细胞几乎找不到,载氢-纳米氧化铈微泡组骨髓细胞有一定数量,存在细胞凋亡现象。本研究表明,载氢-纳米氧化铈微泡通过保护造血组织、改善造血功能,对机体起到一定的辐射防护作用。     

快速测定染色体损伤的微核测定法——Ⅲ.微核测定法评价胱胺和双氧水对骨髓与癌细胞染色体辐射损伤影响的比较研究

本研究工作首次应用微核测定技术快速评价胱胺和H_2O_2在照射前分别或合并使用时,它们对带瘤小鼠的骨髓细胞和艾氏腹水癌细胞染色体辐射损伤的影响。微核测定的结果表明: (1)照前口服或腹注胱胺对受一次或分次照射的腹水癌小鼠骨髓细胞的染色体损伤均有显著性的保护作用,而对其癌细胞的染色体损伤无明显的防护效果。(2)H_2O_2能够提高腹水癌细胞染色体辐射损伤的敏感性,而对其骨髓细胞的染色体损伤无明显的影响。(3)胱胺和H_2O_2合并使用时,H_2O_2不降低胱胺对骨髓细胞的防护作用,而胱胺却能削弱H_2O_2对癌细胞的致敏作用。     

糖蛋白G 基因在基因组P-M 位的插入重组表达对狂犬病毒Flury LEP 致病力的影响

【目的】研究狂犬病病毒Flury鸡胚低代毒株(Flury LEP)在基因组P-M位增加糖蛋白基因(G基因)的重组表达对病毒致病力的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,构建了P、M基因之间额外插入G基因的重组狂犬病病毒Flury LEP株(rLEP-PGM),并对重组病毒的生物学特性及对小鼠的致病性进行了初步研究。【结果】亲本株和重组病毒具有相似的生长特性,LEP和rLEP-PGM在BHK-21细胞的生长滴度分别为4×106 FFU/mL和2.5×106 FFU/mL,在小鼠神经母细胞(NA)的生长滴度分别为4×107 FFU/mL和2.5×107 FFU/mL;嗜神经指数均为1;Western blot显示,rLEP-PGM在感染细胞的G蛋白表达量比LEP显著提高;小鼠感染试验显示,rLEP-PGM与LEP脑内注射小鼠的LD50分别为3 FFU和1 FFU,肌肉注射途径的LD50分别为4×104 FFU和3.2×105 FFU。【结论】P、M基因之间插入一个额外的G基因能够提高G蛋白的表达水平,同时增强重组病毒外周侵入中枢神经系统的能力。     

B淋巴细胞在多向造血祖细胞生长中的地位

小鼠骨髓细胞在体外培养中,加入用流式自由电泳法分离所得的高纯度正常B淋巴细胞,可使多向祖细胞(CFU-mix)集落增加至5倍;加入小鼠B淋巴瘤细胞株的条件培基(M_(12.4.1)-CM)时,CFU-mix数也可增加至4倍。单集落形态学分析结果表明M_(12.4.1)-CM可加强CFU-GEMm及p-BFU-E等早期造血祖细胞的增殖与分化。小鼠高纯度B细胞样品在体外培养中加入1000 rad照射的骨髓细胞可出现CFU-mix集落,如果再加入适量的小鼠肺条件培基,则CFU-mix数量比对照大15倍,其集落性质为CFU-GEMm,GMm及p-BFU-E。在此培养中加不同稀释度抗小鼠IgM血清,结果CFU-mix的产率与抗IgM血清的浓度成直线反比关系,当加入1:10抗小鼠IgM血清时,CFU-mix为0。作者假设在一定培养条件下,IgM阳性的部分B细胞可返祖转化为CFU-mix。     

远红外线对造血干/祖细胞生物学特性的影响

目的:了解远红外线对造血细胞增殖和定向分化的影响.方法:应用体外小鼠骨髓细胞培养技术,观察远红外线对拉-单祖细胞(CFU-GM),红系祖细胞(CFU-E)和成纤维细胞(CFU-F)增殖和分化的影响,并且利用免疫荧光纳米粒子(1FNB)检测靶细胞表面分化抗原(CD),进一步评佑远红外线对造血干/祖细胞的影响.结果:远红外线在37℃条件下照射时CFU-E、CFU-F和CFU-GM生成有促进作用,小鼠骨髓细胞表面标记有变化,靶细胞经2min照射后,增殖最旺盛.2min组与其它实验组(1min,5min,10min)数据经统计学处理,具有差异性(P均<0.05).结论:远红外线时小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖具有正调节作用并可诱导细胞表面标志改变.     

通过反向病毒载体,把大鼠生长激素基因引入小鼠戍纤维细胞-表达与调控

我们通过反向病毒DNA载体,将大鼠的生长激素基因引入培养的小鼠成纤维细跑中,并用病毒诱发受体细胞产生集落的能力作为显性的选择标记。几个考贝的大鼠生长激素DNA整合到小鼠的细胞中。这些转化的小鼠细胞表达了大鼠生长激素特异性mRNA,并分泌成熟的大鼠生长激素。在大鼠细胞中,糖皮质激素调控该基因的表达。我们证明,可以通过克隆转移依靠激素调控的基因,从而证明,这种调控似乎是该基因或其RNA产物的一种内在特性。     

B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立

目的利用基因工程技术全基因合成B型流感病毒B/Yamagata/16/88的8个基因节段,并利用反向遗传技术从体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88,同时建立BALB/c小鼠感染模型,为下一步研究B型流感病毒致病机制、传播机制以及开发新型疫苗奠定基础。方法通过基因合成和反向遗传技术体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88。全基因组测序验证拯救病毒基因组序列与Genbank序列的一致性。将拯救病毒以105EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒复制等方面进行致病性分析,建立小鼠感染模型。结果成功从体外拯救出B型流感病毒B/Yamagata/16/88,命名为B-S9。全基因组测序结果表明,B-S9基因组序列与Genbank公布序列一致。B-S9能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性;攻毒后第3天,B-S9感染小鼠体重出现下降,攻毒后第8天,小鼠体重开始回升;攻毒后第3天和第6天,B-S9感染小鼠的肺脏内均能检测到病毒复制,且攻毒后第3天的小鼠肺脏病毒滴度比攻毒后第6天的小鼠肺脏滴度高132倍。结论成功搭建B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台,并建立BALB/c小鼠感染模型。目前国内外对B型流感病毒的研究比较少,该反向遗传操作平台的建立为B型流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定了基础,同时也为包括B型流感病毒减毒活疫苗在内的新型疫苗的研制开辟了新途径。     

TYRO3~(-/-)AXL~(-/-)MER~(-/-)小鼠骨髓细胞mRNA的差异表达谱

TYRO3、AXL和MER受体是受体酪氨酸激酶亚家族之一,广泛地表达在哺乳动物神经、免疫、生殖、血液等系统多种细胞中,促进细胞存活、增殖和分化。本研究利用基因芯片技术筛选基因敲除的TYRO3~(~(-/-))AXL~(-/-)MER~(-/-)小鼠骨髓细胞中差异性表达的m RNA,并进行生物信息学分析。与正常小鼠骨髓细胞相比,TYRO3~(-/-)AXL~(-/-)MER~(-/-)小鼠骨髓细胞中差异表达基因探针共1 363条,其中表达上调的基因探针499条、下调的基因探针864条。GO功能富集分析发现上调的基因主要参与免疫反应,下调的基因主要参与造血。KEGG Pathway富集分析发现上调的基因主要参与细胞粘附分子和抗原呈递等信号通路。Real-time PCR验证5个差异基因,与芯片中表达变化趋势一致。因此TYRO3、AXL和MER受体共同参与调控机体的免疫反应和血细胞分化。