α-葡萄糖苷酶基因序列分析及真核表达载体构建

目的：Aspergillus niger（CU-1）菌株α-葡萄糖苷酶基因（agdA）克隆并对其序列进行分析,构建该基因的真核表达载体。方法：设计合成的一对特异性引物,采用PCR以总DNA为模板,扩增得到DNA片段（D1）;采用RT-PCR方法扩增得到DNA片段（D2）。将DNA片段D1和D2转入大肠杆菌中并进行了序列测定,序列进行BLAST比对分析。将α-葡萄糖苷酶基因的cDNA片段与表达载体pGAPZαA连接,构建重组表达载体。结果：基因agdA大小为3 127bp,含有3个外显子和4个内含子。该基因的cDNA序列大小为2 958bp,包含完整的编码框,编码985个氨基酸。agdA基因序列与已发表的α-葡萄糖苷基因序列同源性达99%,其中有6个位置的碱基发生了变化。已成功构建重组表达载体pGAPZαA-agdA。结论：Aspergillus niger（CU-1）菌株α-葡萄糖苷酶基因序列分析及重组表达载体pGAPZαA-agdA的构建为在毕赤酵母中表达Aspergillus niger（CU-1）菌株的α-葡萄糖苷酶奠定基础。     

ApCl基因在毕赤酵母中的表达

为了研究ApCl基因的功能,应用基因重组技术将ApCl基因片段克隆入大肠埃希菌—酵母穿梭质拉pGAPZαA,构建重组真核表达质拉pGAPZαA-ApCl,电转化巴斯德单赤酵母GS115,Zeocin筛选出阳性克隆转化子.通过比较转化空载体pGAPZaA和重组载体pGAPZαA-ApCl的不同菌株分别在含有高盐和高山梨醇浓度的液体培养基中生长情况,发现毕赤酵母GS115在转化ApCl基因后其抗旱、抗盐能力显著提高(约3倍),进一步验证了ApCl基因对提高生物抗逆能力有显著作用,为将来分离该蛋白及进一步研究奠定基础.     

人三叶因子1大肠杆菌及毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的:构建人三叶因子1(hTFF1)的大肠杆菌及毕赤酵母表达载体。方法:从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF1 cDNA,用PCR方法扩增hTFF1基因,并将其分别克隆到大肠杆菌的表达载体pET32α及毕赤酵母的表达载体pCAPZαA中,构建原核及真核重组表达质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1。结果:通过双酶切和基因序列分析确定插入pET32α和pGAPZαA中的片段为hTFF1基因片段。结论:重组质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1成功构建,为在比较原核和真核细胞中hTFF1高效表达的情况及下一步的功能研究奠定了基础。     

具血型转换功能的咖啡α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达

从大粒种咖啡(Coffea liberica)和中粒种咖啡(Coffea canephora)中分离克隆到了α-半乳糖苷酶（α-D-galactosidase）cDNA的开放阅读框架即编码区,分别记为Gal-D与Gal-Z,长度与已发表的小粒种咖啡cDNA编码序列相同均为1 089 bp,同源性与已发表的小粒种咖啡cDNA编码序列相比分别为98.7%和99.27%。 将克隆到的Gal-D与Gal-Z用巴斯德毕赤氏酵母Pichia pastoris表达载体pPICZαA（分泌甲醇诱导型）和pGAPZαA（分泌组成型）成功地构建了如下酵母表达载体：pPICZαA/Gal-Z,pPICZαA/Gal-D和pGAPZαA/Gal-D,并转入酵母宿主菌GS115进行了发酵表达研究。实验得出工程菌株pPICZαA/Gal-D / GS115的重组表达产物酶活最高可达48.22（U/mL）,对发酵产物进行了SDS-PAGE电泳,得到一条清晰的主条带。     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×106IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液,酶活性(发酵效价)达到1.2×107IU/mL发酵液以上,较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。     

人可溶性晚期糖基化终产物受体的酵母表达及其生物活性分析

将人可溶性晚期糖基化终产物受体(human soluble Receptor for advanced glycation end product,hsRAGE)cDNA插入巴斯德毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA,构建重组表达载体pGAPZαA-hsRAGE,并转化到毕赤酵母X-33中,利用含抗生素Zeocin的YPD平板筛选重组子。重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的调控作用下,进行组成型分泌表达,在发酵液中获得了相对分子质量约45 kD的重组蛋白。摇瓶发酵结果表明,在发酵温度30℃、pH6.0、发酵时间72 h时重组蛋白表达占发酵上清液总蛋白68.4%。Western blotting显示,重组蛋白能够被相应抗体所识别。纯化后的重组hsRAGE具有与AGEs相互结合的活性,并能够显著地抑制AGEs诱导的人血管内皮细胞系ECV-304细胞NF-κB信号通路中NF-κB/p65基因的表达。     

新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的：利用酵母Pichia pastoris蛋白表达系统,表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。方法：根据新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白(MPAFP5)基因序列设计引物,并分别在5’引物和3’引物中引入了EcoRI和SalI酶切位点,经PCR扩增MPAFP5基因成熟肽序列后与pGEX4T-1载体相连,再将MPAFP5从pGEX4T-1载体上切下亚克隆至穿梭质粒pGAPZαA上,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA-MPAFP5,经线性化后采用电转化法将重组穿梭质粒转入酵母细胞SMD1168内,Zeocin^ 筛选鉴定重组子,小瓶发酵后取上清作SDS-PAGE检测,并用Western-blot检测表达蛋白的正确性。结果：MPAFP5成功地在酵母表达系统获得表达,Western-blot检测表明表达产物为准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。结论：酵母表达系统能够高效表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白,为高密度发酵大量生产抗冻蛋白奠定了基础。     

组成型表达重组人C-反应蛋白的毕赤酵母菌株构建

目的:构建组成型表达重组人C-反应蛋白(Recombinant human C-reactive protein,rhCRP)的毕赤酵母工程菌株,表达、纯化rhCRP并鉴定其免疫反应性。方法:将设计合成的rhCRP基因克隆到表达载体pGAPZαA上并转化至毕赤酵母X-33中进行组成型分泌表达,通过His亲和层析柱纯化rhCRP。分别采用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA法检测目的蛋白并鉴定其免疫反应性。结果:重组表达载体pGAPZαA/rhCRP经酶切及DNA测序鉴定构建成功。重组毕赤酵母工程菌株成功组成型表达23kDa的rhCRP,27h即达到最大表达水平,表达量约3mg/L。经一步分离纯化获得纯度为96.58%的rhCRP,经间接ELISA检测表明其具有免疫反应性。结论:成功构建了组成型分泌表达rhCRP的毕赤酵母菌株,为进一步自主研发人CRP检测试剂奠定了基础。     

特异腐质霉中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆及表达

利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉（Humicola insolerts）H31-3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因egl2的cDNA,将其插入到表达载体pGAPZαA中,重组质粒经线性化,电击转化毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株GS115,筛选到分泌表达重组EGⅡ的毕赤酵母工程菌株。SDS-PAGE检测结果表明,重组EGⅡ在酵母中得到了特异性表达,表达产物的表观分子量约为55kD,同时对工程菌株的发酵条件和重组EGⅡ的性质进行了初步研究。     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα, 插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m 。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×10⁶IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到1.2×10⁷IU/mL发酵液以上, 较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。