人4-1BBL胞外区基因的克隆与表达研究

用RT-PCR方法从人单核THP-1细胞系克隆人4-1BBL胞外区基因,将其重组到pAYZ表达载体中,构建成人4-1BBL胞外区基因表达载体。将该载体转化大肠杆菌16C9,获得稳定表达,表达产物主要以可溶性状态存在;SDS-PAGE和Western blot分析显示,其分子量约为22kD,与预期结果一致。这是首次在大肠杆菌中获得4-1BBL胞外区可溶性表达。生物学活性检测显示4-1BBL对于维持T淋巴细胞系因子释放非常有益,同时PI单染表明它能抑制Jurkat细胞的凋亡。这将在抗肿瘤免疫治疗中具有潜在应用前景。     

人4-1BBL胞外区/抗CD20 Fab’融合蛋白的构建和表达

研究共刺激分子4-1BBL在肿瘤靶向治疗方面的作用, 用PCR 和overlap PCR 方法构建人4-1BBL胞外区/抗CD20 Fab’融合蛋白表达载体, 并用双脱氧终止法测定DNA 序列; 采用亲和层析法纯化该产物, 并用SDS-PAGE和HPLC鉴定纯化产物; 采用玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。DNA 序列测定结果表明: 人4-1BBL胞外区/抗CD20 Fab’融合蛋白已构建成功。表达可溶性产物的产量达200 mg/L以上, 纯度较高, 具有与激活的Jurkat (4-1BBL+) 和Raji细胞(CD20+)结合的活性。这将为非何杰金氏淋巴瘤免疫治疗、靶向治疗提供新的思路。     

人4-1BBL胞外区/抗CD20 Fab’融合蛋白的构建和表达

研究共刺激分子4-1BBL在肿瘤靶向治疗方面的作用, 用PCR 和overlap PCR 方法构建人4-1BBL胞外区/抗CD20 Fab’融合蛋白表达载体, 并用双脱氧终止法测定DNA 序列; 采用亲和层析法纯化该产物, 并用SDS-PAGE和HPLC鉴定纯化产物; 采用玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。DNA 序列测定结果表明: 人4-1BBL胞外区/抗CD20 Fab’融合蛋白已构建成功。表达可溶性产物的产量达200 mg/L以上, 纯度较高, 具有与激活的Jurkat (4-1BBL+) 和Raji细胞(CD20+)结合的活性。这将为非何杰金氏淋巴瘤免疫治疗、靶向治疗提供新的思路。     

基质细胞衍生因子-1及其受体CXCR4与肿瘤的生物学行为

基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)是由基质细胞持续产生并分布广泛的趋化因子,CXCR4则为SDF-1的高度特异性受体.最近研究显示,SDF-1/CXCR4生物轴除了调节肿瘤的侵袭转移能力外,还与多种肿瘤的生物学行为关系密切.本文主要介绍SDF-1/CXCR4的结构与功能、SDF-1/CXCR4与肿痛生物学行为的关系,探讨以SDF-1/CXCR4生物轴为靶点的肿瘤治疗前景.     

共表达人p53、GM-CSF和B7-1基因的重组腺病毒的构建

 为开展肿瘤的复合基因治疗 ,构建以串联方式携带人野生型p53、GM CSF和B7 1基因的重组腺病毒穿梭质粒pBB 1 0 2 .将pBB 1 0 2与腺病毒包装质粒GT40 50共转染 2 93细胞 ,通过细胞内同源重组获得重组腺病毒BB 1 0 2 .在 2 93细胞中扩增病毒 ,并通过氯化铯密度梯度超速离心纯化病毒 ,获得高滴度和高纯度的病毒 .分别经免疫组织化学分析、ELISA和流式细胞分析 ,检测BB 1 0 2介导的人野生型p53、GM CSF和B7 1基因在喉癌细胞Hep 2中的表达 .结果表明 ,BB 1 0 2能够有效地将其所携带的目的基因导入Hep 2细胞并使其在细胞中高效表达 ,表达高峰期为转染后 2～ 4d ,此后随时间递减 ,可持续 1 0d以上 .     

骨巨细胞瘤M-CSF、IL-1和TNF-α免疫组织化学研究

本实验应用免疫组织化学方法,检测巨噬细胞相关抗原、巨噬细胞集落刺激因子（Ｍ┐ＣＳＦ）、白细胞介素┐１（ＩＬ┐１）和肿瘤坏死因子┐α（ＴＮＦ┐α）在骨巨细胞瘤（ＧＣＴ）中的表达,结果表明,在ＧＣＴ中,Ｍ┐ＣＳＦ主要由纤维母细胞样基质细胞（ＦＣ）分泌;巨噬细胞样基质细胞（ＨＣ）是单核┐巨噬细胞系早期的未成熟细胞,主要分泌ＩＬ┐１和ＴＮＦ┐α,少数多核巨细胞（ＭＧＣ）也可产生ＴＮＦ┐α。本文提示,ＧＣＴ中的三种主要细胞能分泌Ｍ┐ＣＳＦ、ＩＬ┐１和ＴＮＦ┐α细胞因子,通过自分泌或旁分泌作用相互影响,共同促进ＧＣＴ的发生、发展及其侵袭性的生物学行为     

SDF-1/CXCR4在肿瘤信号转导中作用的分子机制

CXC趋化因子受体4(CXCR4)是最主要的趋化因子受体之一,在多种类型细胞中均有表达,包括淋巴细胞、造血干细胞、内皮细胞和肿瘤细胞。CXCR4与其配体——基质细胞衍生因子1(SDF-1)(也称CXCL12)结合,能介导多种与细胞趋化、细胞存活或增殖相关信号传导通路。CXCR4与SDF-1轴涉及肿瘤的恶性演进、血管生成、转移和存活。因此,阻断CXCR4与SDF-1轴及下游信号通路成为相关治疗的分子靶标。     

靶向CS1的CAR-T细胞构建及其抗肿瘤活性的体外研究

文中利用基因工程方法构建包含4-1BB或ICOS的第二代Anti-CS1慢病毒表达载体,以及同时包含这两个共刺激因子的第三代Anti-CS1慢病毒表达载体,通过制备相应慢病毒感染人CD3+T细胞,分别获得靶向CS1的第二代和第三代CAR-T细胞。研究结果表明：以ICOS为共刺激因子及以4-1BB为共刺激因子的第二代CAR-T抗肿瘤活性相似,且在效靶比为1︰1时,含ICOS共刺激因子比含4-1BB共刺激因子的第二代CAR-T细胞对IM9-lucgfp细胞的杀伤效力更高;在效靶比为1︰1、2︰1和5︰1时,第三代CAR-T细胞对IM9-lucgfp细胞的杀伤效力低于第二代;在效靶比为10︰1时,二代和三代CAR-T细胞对IM9-lucgfp细胞的杀伤效力都达到85%以上, 显著高于对照组。综上所述,该研究成功构建了靶向CS1的第二代和第三代CAR-T细胞,其可高效杀伤高表达CS1的肿瘤细胞,且靶向CS1的第二代CAR-T细胞比第三代对肿瘤细胞的杀伤效力更强。     

B7—CD28／CTLA4共刺激旁路的组成,功能及其在肿瘤基因治疗中 …

Ｂ７－ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共刺激旁路组成复杂，功能重要，对此共刺激旁路的探索将有助于更好地了解机体的免疫调控及免疫监视；Ｂ７分子的肿瘤基因疗法，尤其是Ｂ７分子联合其它免疫刺激分子的基因疗法是目前肿瘤基因治疗的热蹼和方向，并已在临床应用中获得成功。本文就此几方面作一介绍。     

肿瘤抗原致敏的GM-CSF基因转染巨噬细胞对实验性肺转移肿瘤的治疗作用

研究将对巨噬细胞双重功能均具有激活作用的细胞因子GM-CSF的基因转染小鼠腹腔巨噬细胞,再经肿瘤抗原致敏后通过静脉注射用于实验性CT26结肠癌肺转移小鼠的治疗.结果表明,腺病毒介导的GM-CSF基因转染小鼠腹腔巨噬细胞在转染后4h即可分泌较高水平的GM-CSF.转染后10d仍可有效表达;转染后16h左右小鼠腹腔巨噬细胞MHCⅡ类分子的表达明显增强,其抗原提呈能力也达最高水平;对肿瘤细胞的杀伤活性显著增高;荷瘤3d的实验性CT26结肠癌肺转移小鼠经肿瘤抗原致敏的GM-CSF基因转染巨噬细胞治疗后第16天肺部转移结节数明显减少;经治疗小鼠脾细胞经诱导的CTL杀伤活性也明显升高.以上结果提示,GM-CSF基因转染及表达能有效增强小鼠腹腔巨噬细胞的抗原提呈能力及效应功能;经肿瘤抗原刺激后其对转移性肿瘤也有明显的治疗作用.     

人IL-12和B7-1基因对HuPBL-SCID小鼠模型中人源肿瘤的协同抑制作用

人IL 12 (hIL 12 )对鼠源的免疫细胞作用较弱 ,进行hIL 12抗瘤研究缺乏有效的动物模型。为此利用荷人瘤的HuPBL SCID小鼠模型 ,将改良的Winnassay细胞免疫功能分析方法应用于评价hIL 12和hB 1协同抗瘤作用。用商业化的非脂质转基因试剂配制单独的hIL 12、hB7 1或hIL 12联合hB7 1的基因转染液。将上述三种基因转染液分别瞬时转基因入人恶性黑色素瘤A375细胞 ,转基因 30min后 ,按组别 (hIL 12组、hB7 1组、hIL 12 hB7 1组、rhIL 2对照组、HuPBL对照组和肿瘤对照组 )同人外周血淋巴细胞混合接种于SCID小鼠皮下 ,2 0天后处死实验小鼠 ,测得hIL 12和hB7 1的抑瘤率分别为 74 .0 6 %和 6 6 .98% ,联合作用达 93.4 0 % ,rhIL 2和HuPBL对照组无抗瘤作用。同时 ,在此模型上hIL 12联合hB7 1基因对人大肠癌LoVo和人肺癌SPC的抑制率分别为 98.37%和 97.39%。实验建立的各组HuPBL SCID小鼠 2 0天的外周血都含有人IgG(>0 .5mg/L)和极少量人CD3 淋巴细胞 (>0 .5个 /10 0个有核细胞 )。hIL 12、hB7 1和hIL 12 hB7 1组的瘤灶内人淋巴细胞浸润生长 ,肿瘤细胞残存 ,而rhIL 2和HuPBL对照组的瘤灶内人淋巴细胞“似团样”生长 ,肿瘤生长旺盛。表明此HuPBL SCID小鼠模型上的抗瘤机制为局部免疫反应。结果表明以此动物模型可跨     

葡萄糖和肿瘤坏死因子-α对内皮细胞中早期生长反应基因-1表达的影响

目的探讨葡萄糖和肿瘤坏死因子-α对内皮细胞中早期生长反应基因-1表达的影响。方法利用人脐静脉内皮细胞体外培养,予以25mmol/L葡萄糖和/或10ng/ml肿瘤坏死因子-α与内皮细胞共同孵育,运用蛋白免疫印迹方法检测细胞中早期生长反应基因-1蛋白的表达,运用酶联免疫吸附法检测纤溶酶原激活抑制物-1的表达。结果葡萄糖和肿瘤坏死因子-α均可增加早期生长反应基因-1的表达,两种因素共同作用产生协同作用。而且,葡萄糖和肿瘤坏死因子-α也可促进纤溶酶原激活抑制物-1的表达。细胞外调节蛋白激酶1/2的抑制剂(PD98059)可下调肿瘤坏死因子-α所诱导的早期生长反应基因-1、纤溶酶原激活抑制物-1的表达,而对葡萄糖所诱导的早期生长反应基因-1的表达无明显影响。结论肿瘤坏死因子-α可能通过细胞外调节蛋白激酶1/2路径促进早期生长反应基因-1和纤溶酶原激活抑制物-1表达。肿瘤坏死因子-α和葡萄糖可能通过不同的信号通路调节早期生长反应基因-1、纤溶酶原激活抑制物-1表达,在肥胖、糖尿病等代谢紊乱所致的血管并发症的发生中起到重要的作用。     

TIPE2在炎症、免疫相关疾病和肿瘤中的研究进展

肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8样分子2(tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like 2,TIPE2)是一种新型的先天免疫和细胞免疫的调节因子。TIPE2负向调节Toll样受体和T细胞受体的功能,其在免疫系统的选择性表达可抑制炎症反应并维持免疫稳态。大量研究表明,TIPE2是多种肿瘤生成和肿瘤免疫平衡动态调节的负性调节分子,是自然杀伤(natural killer,NK)细胞成熟和抗肿瘤免疫的潜在检查点。TIPE2在炎症、免疫相关疾病和肿瘤的发生发展过程中起重要作用,具有作为临床生物标志物的潜力。本文总结了TIPE2的结构特点、生物学功能及其在疾病中的异常表达和临床意义,为疾病治疗提供新的策略。     

类风湿关节炎中白三烯B4诱导TNF-α和IL-1β的表达

为了探讨类风湿关节炎的发病过程中白三烯B4(leukotriene,LTB4)对TNF-α和IL-1β表 达的影响.加入外源性LTB4或者在LIT存在的情况下,加入苯丁抑制素(bestatin,LTA4水解酶 抑制剂)和MK-886(5-脂氧合 酶激动蛋白抑制剂)后, 采用实时PCR和酶联免疫吸附分析法来检测原代培养的类风湿滑膜细胞及培养上清液中TNF-α和IL-1β在mRNA及蛋白水平的表达.外源性的LTB4 10^-8mol/L使TNF-α和IL-1β mRNA水平表达分别增加了14倍和1倍, 蛋白水平分别增加了3倍.加入LIT刺激内源性的LTB4增加了14倍后,使TNF-α和IL-1βmRNA水平表达分别增加了145倍和12倍, 蛋白水平分别增加了3倍.在LIT存在的情况下, MK-886 10 μmol/L使LTB4合成降低了62%(P<0.000 1), 使TNF-α和IL-1β mRNA水平表达分别降低了66%(P<0.05)和71%(P<0.001),它们的蛋白水平分别降低了75%和70%(P<0.01). 100 μg/ml苯丁抑制素使LTB4合成降低了78%(P<0.000 1), 使TNF-α和IL-1β mRNA水平表达分别降低了86%(P<0.001)和79%(P<0.01), 它们的蛋白水平分别降低了84%和76%(P<0.05). 在类风湿关节炎中,LTB4诱导TNF-α和IL-1β的表达. 这一结果为类风湿关节炎发病机制进一步探讨提供了一条新思路.     

健康人群肿瘤坏死因子-α基因多态性的分析

了解汉族健康人群中TNF-A基因多态性的分布,研究TNF-α表达与相关疾病之间的联系。采用PCR-限制性长度片段多态分析法检测140名重庆地区汉族健康人群的TNF—A-308,TNF—A-857位点基因多态性,计算其基因型和等位基因频率,结果显示TNF-A-308G／G、G／A、4朋基因型的频率分别为89％、11％、1％,其等位基因的发生频率以G等位基因最常见（93％）,其次为A等位基因（7％）。TNF—A-857C／C、C／T、形,基因型的频率分别为68％、36％、8％,其等位基因发生频率以C等位基因最常见（81％）,其次为T等位基因（19％）。由结果可以得出重庆地区汉族健康人群TNF—A-308位点存在G／A多态性,TNF-A-857位点存在C／T多态性。     

人免疫缺陷病毒1型Rev单链抗体细胞内免疫抗病毒基因治疗研究

应用抗ＨＩＶ－１Ｒｅｖ单链抗体细胞内免疫方法,研究在人Ｔ细胞和周围血淋巴单核细胞内抗病毒复制的效果,探讨细胞内免疫抗ＨＩＶ－１基因治疗的可行性。克隆抗ＨＩＶ－１Ｒｅｖ单链抗抗体（ｓＦｖ）基因,以逆转录病毒为基因载体,将名装后的含靶基因的逆转录病毒转导至人ＣＤ４阳性Ｔ－细胞株ＣＥＭ和ＳｕｐＴ１,以及ＨＩＶ－１阴性自愿者的周围血淋巴单核细胞（ＰＢＭＣ）,再分别用不同剂量（ＭＯＩ）的ＨＩＶ－１病毒株ＰＮ     

白介素-1和肿瘤坏死因子-α基因多态性与幽门螺杆菌相关性胃十二指肠疾病的关系

目的探讨汉族人群中IL-1和TNF-α基因多态性与H.pylori相关性胃十二指肠疾病之间的关系。方法选取H.pylori阳性的142例胃十二指肠疾病患者和140例健康对照者,采用PCR-限制性长度片段多态方法检测该人群中IL-1B-511、TNF-A-308、TNF-A-857位点多态性和IL-1受体拮抗剂基因的多态性。结果 IL-1B-511和IL-1RN各基因型的频率在疾病组和对照组中的分布差异无统计学意义。在疾病组中TNF-A-308和TNF-A-857各基因型的频率与对照组比较,分布有差异,具有统计学意义(P0.05)。经Logistic回归分析,与携带TNF-A-308G/G者比较,携带TNF-A-308 A/A者发生胃十二指肠疾病的危险性为OR=15.37(95%CI:3.50-67.50);携带TNF-A-308 A/G者发生胃十二指肠疾病的危险性为OR=5.12(95%CI:2.54-10.34);与携带TNF-A-857 C/C者相比较,携带TNF-A-857 T/T者发生胃十二指肠疾病的危险性为OR=3.20(95%CI:1.35-7.60)。结论 IL-1B-511和IL-1RN各基因型与幽门螺杆菌相关性胃十二指肠疾病的发生不相关。TNF-α基因多态性与幽门螺杆菌相关性胃十二指肠疾病的发生相关。     

人集落刺激因子-1(CSF-1)对常见呼吸道病毒的抑制作用

本文观察集落刺激因子-1(CSF-1)及其诱生剂:内毒素(LPS)、胞壁二肽(MDP)和干扰素(IFN-α)对下列病毒所致细胞病变的抑制,包括不同型别腺病毒5株,单疱病毒Ⅰ型和Ⅱ型,流感病毒A_3型,鼻病毒,ECHO11型各1株,在人胚肺传代细胞株上病变抑制的结果如下:对HSV-1、HSV-2、腺病毒6、11、22型,流感A_3型,鼻病毒。(CSF-1)和IFN-α,一样有明显抑毒效果,LPS MDP联合使用对以上病毒有明显增强抑毒作用。CSF-1和IFN-α的抑毒作用能分别被CSF-1和IFN-α的抗体所解除。 CSF-1在人胚肺传代细胞和人胚皮肤肌肉传代细胞上对VSV的抑毒效果在人胚肺细胞中效果比人胚皮肤肌肉细胞更明显。LPS10ng/ml作用48小时比作用24小时效果更强。LPS MDP和IFN-α对二种细胞都有同样高效的抑毒作用。     

TRAF1的表达及其与TRAF2结合的改变与不同乳腺癌细胞系转移潜能的关系

目的肿瘤坏死因子受体相关因子1（Tumor necrosis factor receptor-associated factor1,TRAF1）在乳腺癌中的表达及作用尚不清楚。本研究探讨TRAF1的表达水平及其与TRAF2结合量的改变与乳腺癌不同转移潜能的相关性。方法利用免疫细胞化学和western blot的方法检测在具有不同转移潜能的人乳腺癌细胞系中TRAF1表达水平;通过免疫共沉淀的方法检测在上述细胞系中TRAF1与TRAF2结合的改变。结果TRAF1在高转移潜能乳腺癌细胞系中的表达高于正常及中/低转移的乳腺癌细胞系（P〈0.05）;TRAF1与TRAF2的结合量在高转移潜能乳腺癌细胞系中低于正常及低转移的乳腺癌细胞系（P〈0.05）。结论随着乳腺癌转移潜能的增高,TRAF1总蛋白表达水平递增,而与TRAF2结合的TRAF1蛋白量递减;提示TRAF1可能通过减少与TRAF2结合而减弱对TRAF2的抑制作用,从而促进乳腺癌的浸润与转移。