胶原蛋白降解物高效液相色谱/质谱联用分析

利用高效液相色谱／质谱联用技术分析了胶原蛋白Ⅱ和Ⅰ经变性和酶解处理得到的多肽混合物,比较研究了两种类型胶原蛋白降解物之间的区别,利用液相色谱质谱连用技术识别出了不同类型胶原蛋白中的特征肽段。胶原蛋白在50℃处理3h可溶解于盐溶液,凝胶过滤分析结果表明,热变性的胶原蛋白分子量在10万以上,因此在热变性过程中胶原蛋白的三螺旋结构被破坏但没有明显的随机降解。利用胰蛋白酶对胶原蛋白进行了酶切处理,在酶用量为2％,pH 8.1~8.2,温度37℃条件下,处理20h后胶原蛋白降解较完全,多肽混合物的平均分子量在1万以下。利用液质联用技术研究Ⅱ型和Ⅰ型胶原蛋白降解物中的多肽,通过多级质谱分析了胶原蛋白降解物多肽的序列。结果表明,不同类型的胶原蛋白酶解后的多肽混合物中存在特定序列的特征肽段,利用特征肽段进行胶原蛋白类型识别是可行的。     

基于生物质谱的胶原蛋白定量检测方法

本研究旨在建立一种基于特征多肽的胶原定量检测方法,通过序列比对的方法筛选胶原蛋白特征多肽,利用胰蛋白酶将牛Ⅰ型胶原蛋白标准品进行酶解,采用液质联用技术(HPLC-MS)对特征多肽进行检测,建立特征多肽丰度与胶原蛋白浓度对应关系并用于实际样品分析。结果表明,牛Ⅰ型胶原蛋白中检测出6种特征多肽,其中多肽GEAGPSGPAGPTGAR由于其丰度高且二级质谱稳定适合作为定量检测的特征多肽,多肽信号强度与蛋白浓度(0.1-3.0 mg/m L)呈良好线性关系。将所建方法用于实际样品分析,牛跟腱胶原蛋白含量为90.2%,胶原海绵中胶原蛋白含量为93.4%,检测结果与基于氨基酸组成分析的结果一致。该研究表明基于HPLC-MS的特征多肽分析方法进行胶原蛋白定量检测具有可行性,该方法在含胶原蛋白医疗器械等生物制品质量控制方面具有应用前景。     

基于液相色谱-质谱技术的早期胃癌血清多肽组学研究

目的:建立早期胃癌外周血清特征性多肽谱,分析其生物学特征,以探索一种特异且敏感的早期胃癌血清学诊断方法。方法:采集10例早期胃癌和10例正常对照血清,使用蛋白沉淀法去除高丰度血清蛋白质后,通过液相色谱-质谱联用技术重复三次进行多肽分离、离子化、质谱检测,将原始数据应用Label free方法中Max Quant算法对肽段进行相对定量,分析两组差异多肽及差异多肽匹配蛋白。结果:EGC组和N组重复三次所得色谱图总体比较一致,多肽重复检出率分别为87.54%和85.67%。其中EGC组可重复检测到的Unique peptide有65条,匹配对应31个蛋白;在EGC组和N组血清中显著差异的Unique peptide有22条,匹配对应11个蛋白。对血清显著差异多肽所匹配蛋白进行生物学分析,发现这些蛋白质多数位于细胞外,功能类别主要涉及分子水平的序列变换、信号肽、N-糖基化位点等,信号通路主要富集在凝血级联通路和补体级联通路。结论:早期胃癌血清特异性多肽谱图的建立可望成为胃癌早期诊断的血清学标志物,后续试验将进一步针对这些差异多肽进一步分析验证,筛选出早期胃癌标志性多肽,同时应用大样本进行验证,筛选出特异高效的早期胃癌血清标志物。     

高效液相色谱-串联质谱检测基因组DNA甲基化方法的建立

目的:建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)检测基因组DNA甲基化水平的方法。方法:以5-mdC和dG为标准品,采用全自动高效液相色谱系统进行分离,串联电喷雾质谱检测,选择多反应监测模式(MRM)测定标准品,绘制标准工作曲线。结果:在MRM模式下选取5-mdC(m/z 241.9→126.3)和dG(m/z 268.1→152.3)分别作为定量检测的母子离子对,各化合物能实现良好的基线分离;5-mdC和dG碰撞能均为15 eV,去簇电压分别为40和45 V,最低定量限分别为1.65和2.47 fmol;标准品的响应值比为90%~110%;5-mdC含量的天内相对标准偏差和天间相对标准偏差均小于8%。结论:HPLC-ESI-MS/MS是能应用于检测基因组DNA甲基化的一种高通量、高准确率、高分辨率、高灵敏度且重复性好的方法。     

液相色谱/质谱联用法分析不同年龄鼠皮肤中I型、III型胶原蛋白相对含量

哺乳动物皮肤中真皮内的胶原蛋白含量约占70%,主要是I型、III型和少量V型胶原蛋白。利用稀酸溶解和酶法提取了大鼠皮肤中的总胶原蛋白,将胶原蛋白粗提品在60℃变性后用胰蛋白酶进行降解,液相色谱/质谱联用法分析两种胶原蛋白的特征多肽,并研究不同生长期大鼠皮肤中I型和III型胶原蛋白相对含量。结果表明,大鼠皮肤中的III型胶原蛋白的相对含量随生长期延长逐渐降低,而I型胶原蛋白的相对含量逐渐升高,8周后两种胶原蛋白的比例趋于稳定。表明使用高效液相色谱/质谱联用法分析组织中的胶原蛋白类型及其动态变化具有可行性,为更好的临床应用提供实验基础。     

液相色谱/质谱联用法分析不同年龄鼠皮肤中I型、III型胶原蛋白相对含量

哺乳动物皮肤真皮中胶原蛋白含量约为70%,主要为是I型、III型胶原蛋白,本实验利用稀酸溶解和酶法提取了大鼠皮肤中的总胶原蛋白,将胶原蛋白粗提品在60℃变性后用胰蛋白酶进行降解,液相色谱/质谱联用法分析了两种胶原蛋白的特征多肽,利用特征多肽比较了不同生长期大鼠皮肤中I型和III型胶原蛋白相对含量。结果表明,大鼠皮肤中的III型胶原蛋白的相对含量随生长期延长逐渐降低,而I型胶原蛋白的相对含量逐渐升高,8周后两种胶原蛋白的比例趋于稳定。本实验结果表明使用高效液相色谱/质谱联用法分析组织中的胶原蛋白类型及其动态变化具有可行性,为更好的临床应用提供了实验基础。     

建立高效液相色谱-串联质谱检测细胞内腺苷酸浓度的方法及其应用

细胞内腺苷酸浓度变化是细胞能量代谢改变的感应器,建立高效液相色谱-串联质谱法检测细胞内腺苷酸浓度的方法有助于监测药物对细胞能量代谢的影响．用含有Na-EDTA的高氯酸溶液超声裂解细胞．采用超高效HSS T3色谱柱 (2.1 mm ×100 mm, 1.8 μm),以8 mmol/L N, N-二甲基己胺(DMHA)水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱,采用正离子模式质谱检测,在多反应监测(MRM)模式下进行定性定量分析．结果表明,AMP、ADP和ATP分别在(0.1814～14.5164) μmol/L、(0.2342～18.7354) μmol/L和(0.2003～16.0260) μmol/L线性范围内具有良好的线性关系,其相关系数分别为0.9984、0.9964和0.9990．AMP、ADP和ATP的检出限(LOD,S/N>3)分别为1.9291、1.8794 和166.5 nmol/L,定量限(LOQ,S/N>10)为1.9632、1.9672和185.6 nmol/L,且加标回收率为81.8% ～107.8%,相对标准偏差小于7.55%．AMP、ADP和ATP的日内偏差(RSD)分别为6.16%、5.13%和7.66%,日间偏差(RSD)分别为6.36%、2.74%和6.77%．该方法快速、简单、灵敏,能满足细胞内AMP、ADP和ATP含量的检测要求．通过检测分析在不同浓度高良姜挥发油作用下人肺癌A549细胞内AMP、ADP和ATP含量变化,结果显示细胞总的腺苷酸水平和能荷呈浓度依赖性下降,且当浓度达到500 mg/L时ATP/TAN明显下降,而A549细胞中AMP/ATP比例水平呈浓度依赖性增加．这提示高良姜挥发油可通过影响细胞能量代谢抑制细胞增殖．     

超高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱鉴定灵芝中脂质成分

脂质是灵芝重要活性成分之一,但目前对灵芝胞内脂质成分的构成研究甚少。本研究采用UPLC-ESI-MS/MS技术,对灵芝发酵菌体的胞内脂质构成进行分析。结果显示,灵芝细胞中共鉴定到296种脂质,其中甘油酯112种、磷脂148种、鞘脂34种和甾醇2种;甘油酯和磷脂分别占总脂质的44.70%和38.06%,鞘脂和甾醇分别占总脂质的17.08%和0.16%。分析甘油酯中主要成分为甘油三酯,占甘油酯总含量的67.36%;磷脂中主要成分为磷脂酰乙醇胺,占磷脂总含量的62.64%;鞘脂中主要成分为神经酰胺,占鞘脂总量的60.33%;此外,本研究检测出27种游离脂肪酸,其中20种为不饱和脂肪酸,相对含量为65.59%;7种为饱和脂肪酸,相对含量为34.41%。本研究系统性地分析了灵芝细胞中的脂质构成,为进一步开展灵芝细胞中脂质相关研究奠定基础。     

高效液相色谱-串联质谱分析微量格尔德霉素类似物

安莎类抗生素例如利福霉素和安丝菌素,通常由一组化学结构相似的组分组成。格尔德霉素为苯安莎类抗生素,已经发现4个组分。本研究采用高效液相色谱-串联质谱方法对格尔德霉素(GDM)制品中的微量组分进行了分析,发现5个新的和1个已知的GDM类似物。依据质谱数据、结合GDM生物合成机制,对6个GDM类似物的化学结构进行了推测:分子式为C29H42N2O10的新化合物3个,分别为GDM安莎链上C2-C3、C4-C5和C8-C9之间的C-C双键变为单键并同时单羟基化的GDM衍生物;分子式为C28H38N2O8的新化合物2个,其中1个为17(或12,或4)-去甲氧基格尔德霉素,另1个为4,5-双氢-10,11-脱水-17-去甲基-17-羟基格尔德霉素;分子式为C29H42N2O9的已知化合物1个,为4,5-双氢格尔德霉素。这些GDM类似物的发现有助于加深对GDM生物合成的认识,并对通过基因阻断、组合生物合成技术获得GDM衍生物的研究有启示作用。     

液相色谱/光谱(紫外、质谱及核磁共振)联用技术在中草药有效成分研究中的应用

本文综述了液相色谱／光谱(紫外、质谱及核磁共振)联用技术的最新进展及其在中草药有效成分研究中的应用。并对这一新技术在实际应用中的优缺点及应用前景进行了分析和展望。     

液相色谱-串联质谱分析化学合成多肽及其主要副产物(英文)

用与反相高效液相色谱偶联的串联质谱 (RPHPLC MS MS)分析一个固相化学合成的九肽H2 N Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys CONH2 及其 2个主要的副产物 .根据Fmoc化学 ,在Fmoc PAL PEG·PS树脂上从C端至N端手工操作逐步偶联合成九肽 .偶联完成后 ,用试剂R(90 %TFA ,5 %苯甲硫醚 ,3%二巯基乙烷 ,2 %苯甲醚 )室温 (2 0～ 2 5℃ )处理 2 5h ,进行多肽的去保护和切除树脂 .RP HPLC分析结果表明 ,合成粗品中含有 1个主要成分、2个次要成分及多个微量成分 .用RPHPLC MS MS分别对主要成分和 2个次要成分进行了鉴定 .结果证明 ,主要成分即为目标九肽 ;先于目标肽洗脱的副产物分子量比目标肽的分子量多 16 .MS MS证明 ,该副产物包括 2种九肽衍生物 :1种为其Tyr1氧化生成 ,另 1种为Met6氧化生成 ;后于目标肽洗脱的副产物为九肽的Tyr1残基增加 12所致 ,这种现象尚未见报道 .对副产物形成的可能机制进行了讨论     

Evaluation of HCH,DDT and Endosulfan Levels in Soil by Gas Chromatography/Tandem Mass Spectrometry

Persistent organic pollutants (Σ DDX, Σ HCH, and Σ Endosulfan) were quantified in top soil and deep soil of a pesticide manufacturing industry. It was also possible to identify the presence of some other organochlorinated compounds (OCs) in the soil. A suitable multiresidue analysis of persistent organic pollutants in soil samples was developed based on soxhlet extraction and gas chromatography–mass spectrometry for quantifying parent compounds and degradation products, namely OCs and other miscellaneous pesticides. The quantification protocol was developed using Programmed Temperature Vaporization (PTV) and GC/MS/MS as identification tools. Extraction, PTV and MS/MS conditions were optimized for 11 pesticides with unambiguous spectral confirmation. The protocol has been applied to a large number of environmental samples and has proved to be reliable. The degradation ratios between the parent substances and their metabolites (DDX and HCH isomers) were calculated to determine whether there were any fresh inputs of parent pesticide at the site. Pesticide concentrations in the low to high concentration range (159 μ g/kg to 133 mg/kg) have been measured. The investigations clearly indicate pesticide contamination in the soil.     

毛细管区带电泳／串联质谱联用法鉴定多肽和蛋白质

建立了毛细管区带电泳－串联质谱联用（ＣＺＥ／ＭＳ／ＭＳ）对多肽和蛋白质高灵敏度鉴定方法,对Ｍｅｔ－脑啡肽和Ｌｅｕ－脑啡肽的混合物进行了分析,用ＣＺＥ／ＭＳ／ＭＳ方法验证了各自的序列,同样对细胞色素ｃ的胰蛋白酶酶解产物用ＣＺＥ／ＭＳ／ＭＳ方法进行了肽质谱分析,几科所有肽段的序列及其与在分子中的位置都得到了确定,通过ＳＥＱＵＥＳＴ软件进行蛋白质序列数据库搜索得到准确的鉴定结果,所消耗的样品量均在低皮可     

Analysis of Bitter honey using gas chromatography and Tandem Mass Spectrometry

Honey has been consumed by humans since ancient times. Honey contains volatile compounds like aldehyde, alcohol, ketone, hydrocarbon, terpenes, acids, benzene compounds. These compounds represent the fingerprint of monofloral honey there by providing information about the floral and geographical origin of honey. The volatile compounds present in honey not only contribute the aroma but also associated with the therapeutic activities of honey. In the present study, the GCMS/MS analysis of bitter honey was carried out to identify the presence of volatile compounds. This is the first study to determine the volatile compounds from ethyl acetate extract of bitter honey produced in the Nilgiri biosphere. Among the eighteen compounds detected, the majority of the compounds were reported to be therapeutically active. Hence further studies regarding the isolation of these compounds could be beneficial in the treatment of various diseases.     

液相串联质谱法同时定量检测生物样本中鞘脂类化合物

鞘脂类中的主要活性分子鞘氨醇1-磷酸（S1P）,可通过介导细胞增殖、分化和迁移等发挥广泛的生物学功能|同时,S1P可在相关酶的作用下转变为其它形式.本文旨在建立一种简便的鞘脂类的制备方法,并结合液相串联质谱（LC-MS/MS）快速检测生物样本中纳克水平的鞘脂类化合物. 采用甲醇沉淀或经典的脂质提取方法获得鞘脂类化合物,再采用LC-MS/MS在多反应监测模式（MRM）下进行定量分析. 实验结果表明,甲醇沉淀法可简便快捷地获得血浆或脂蛋白中鞘氨醇类化合物; S1P、二氢鞘氨醇（DH-S1P）和鞘氨醇（SPH）的定量限分别为110.5、215.6和44.3 pg;人血浆中S1P、DH-S1P和SPH的含量分别为257.8±49.4 nmol/L、93.5±17.3 nmol/L和44.6± 7.4 nmol/L, 鞘脂类化合物在人血浆脂蛋白上的分布存在显著性差异|在ApoE-/-小鼠血浆中S1P、DH-S1P和SPH的含量分别为590.1±78.2 nmol/L、197.8±60.6 nmol/L和35.4±16.7 nmol/L|每1×106个人脐静脉内皮细胞（EA.hy926）中,S1P和SPH的含量分别为103.7±21.8 pg和16.3±5.3 ng.甲醇沉淀法结合LC-MS/MS可简便快捷地对血浆和脂蛋白中的鞘脂类化合物进行定量检测. 该方法特别适用于大量生物样本中鞘脂类的快速定量分析.     

气相色谱-质谱法测定中药沙苑子中的氨基酸

本文利用气相色谱一质谱(GC/MS)联用技术首次对中药沙苑子中的氨基酸进行了定性定量分析。沙苑子经盐酸水解后,对其氨基酸水解液进行羟基脂化和氨基酰化的衍生化反应,利用GC/MS法共测得15种氨基酸,由外标法测定了每种氨基酸的含量。由此得出沙苑子中氨基酸的总质量分数为4.23％。     

用于串联质谱鉴定多肽的计量方法

目前已有多种对串联质谱与数据库中多肽的理论质谱的一致性进行评估的高通量计量算法用于鸟枪法蛋白质组学 (shotgunproteomics)研究。然而这些方法操作时存在大量错误的多肽鉴定。这里提出一种新的串联质谱识别多肽序列的计量算法。该算法综合考虑了串联质谱中不同离子出现的概率、多肽的酶切位点数、理论离子与实验离子的匹配程度和匹配模式。对大容量的串联质谱数据集的测试表明 ,根据算法开发的软件PepSearch比目前最常用的软件SEQUEST有更好的鉴定准确性。PepSearch可从http : compbio.sibsnet.org projects pepsearch下载。     

Enantioselective Determination of the Insecticide Indoxacarb in Cucumber and Tomato by Chiral Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry

A convenient and precise chiral method was developed and validated for measuring indoxacarb enantiomers in cucumber and tomato using liquid chromatography‐tandem mass spectrometry (LC‐MS/MS) with a reversed‐phase Chiralpak AD‐RH column. The target analytes were extracted by acetonitrile and then purified by solid phase extraction (SPE) using NH₂/Carb combined‐cartridge. Parameters including the matrix effect, linearity, precision, accuracy, and stability were used. Then the proposed method was successfully applied to investigate the possible enantioselective degradation of rac‐indoxacarb in cucumber and tomato under open conditions. The results indicated that the degradation of indoxacarb enantiomers followed first‐order kinetics in cucumber and tomato. The half‐lives of (+)‐S‐indoxacarb in cucumber and tomato were 3.0 and 5.9 days, respectively; while the (–)‐R‐indoxacarb were 7.3 and 12.2 days, respectively. The data of the half‐lives showed that (+)‐S‐indoxacarb was preferentially degraded in cucumber and tomato. Moreover, indoxacarb degraded faster in cucumber than in tomato. Chirality 25:350–354:, 2013. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.     

十种一碳代谢关键产物的HPLC-MS/MS 定量检测方法

目的:利用HPLC-MS/MS方法对十种一碳代谢相关产物进行定量分析。方法:采用Aglient ZORBAX SB-AQ C18柱(2.1mm×100 mm,3.5 m)、电喷雾离子源(ESI),以多离子反应监测方式(MRM)进行正离子检测。对游离叶酸(FA)、5-甲酰四氢叶酸(5-FT)、5-甲基四氢叶酸(5-MT)、S-腺苷蛋氨酸(SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)、胱硫醚(CYSTA)、组氨酸(HIS)、丝氨酸(SER)、蛋氨酸(MET)、同型半胱氨酸(HCY)进行定量分析。结果:FA、5-FT、5-MT、SAM、SAH、CYSTA、HIS、SER、MET、HCY的检测限分别为0.1 ng.L-1、0.25 ng.L-1、0.1 ng.L-1、0.1 ng.L-1、0.25 ng.L-1、0.25 ng.L-1、0.1 ng.L-1、0.025 ng.L-1、0.1 ng.L-1、0.1 ng.L-1。FA、5-FT、5-MT、SAH、CYSTA浓度测定方法线性范围为2~50 ng.L-1,SER、SAM浓度测定方法线性范围20~500 ng.L-1,MET、HCY浓度测定方法线性范围200~5000 ng.L-1,HIS浓度测定方法线性范围为400~10000 ng.L-1,r均在0.993以上,全部涵盖了已报道的血清中指标的含量范围。结论:建立了HPLC-MS/MS方法,可同时分析十种一碳代谢通路的关键产物,所需样品量少,检测速度快,同时实现分项检测,可为多种代谢性疾病系统性地检测一碳代谢中间产物体液分析方法建立实验条件基础。