重组人MBD4蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

为获得重组人MBD4蛋白,将编码MBD4的开放式阅读框（ORF）插入原核表达载体pGEX6P1 GST基因下游的多克隆位点（MCS）.将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3) 菌株扩大培养并用IPTG诱导融合蛋白的表达.用谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B亲和介质从菌体裂解液中纯化了GST-MBD4融合蛋白.经过Prescision protease专一性裂解成功去除了融合蛋白上的GST标签.通过Mono Q阴离子交换层析获得了纯度达94%以上的MBD4蛋白,该蛋白具有甲基化DNA结合和糖苷酶生物活性.     

融和蛋白GST-SUMO-MT在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

将编码融合蛋白GST-SUMO-MT的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-GS-MT并转化到大肠杆菌Origami（DE3）中。20℃,1mM的IPTG诱导20h后,获得分子量约为43Kd的融合蛋白,表达量占菌体上清总蛋白的38.4％。利用谷胱甘肽交联琼脂糖（Glutathione Sepharose 4B）凝胶柱和Sephardex G-25分子筛联用可以得到纯度为95%以上的融合蛋白,得率约为70mg/L。该融合蛋白可与GST抗体产生阳性反应。融合蛋白GST-SUMO-MT可以显著提高宿主对Cd2+、Zn2+和Cu2+离子聚积的能力,其耐受能力比对照组分别提高4.2倍、4倍及1.6倍。此外,原子吸收光谱法测定,每分子GST-SUMO-MT可以结合2-3个Cd2+离子。     

天花粉蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

天花粉蛋白 (Trichosanthin ,TCS)全长基因通过PCR从 pCDNA3 1中获得 ,克隆至表达载体中。双向测序表明获得的天花粉蛋白全长基因序列正确。建立大肠杆菌原核表达系统 ,表达并纯化His TCS活性融合蛋白 ,鉴定出其具有RNAN 糖苷酶活性和与TCS特异性单克隆抗体TE1 (IgE)结合的抗原活性     

重组人LIF融合蛋白表达纯化及其活性鉴定

目的:原核表达重组hLIF融合蛋白并进行诱导表达、纯化及活性鉴定.方法:将hLIF基因克隆至pThioHisA载体,构建融合表达载体pThioHisA-hLIF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经亲和层析后,Western blot检测目的蛋白的特异性.用小鼠胚胎干细胞脱饲养层培养对纯化后的重组hLIF融合蛋白进行生物活性的鉴定.结果:降低诱导温度和延长诱导时间能增加hLIF融合蛋白的可溶性表达,纯化后的重组蛋白纯度大于95％,Western blot检测显示了良好的特异性.在脱饲养层细胞培养条件下,添加纯化的hLIF融合蛋白能够有效的维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态.结论:重组hLIF融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达,具有良好的特异性,为干细胞研究及hLIF蛋白的其他功能研究奠定了基础.     

新型载体蛋白P64K在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化

用常规PCR方法从脑膜炎球菌中克隆出P64K基因,构建重组质粒pET28a-P64K转化BL21(DE3)宿主菌,经眦诱导表达筛选P64K蛋白的高表达菌株。结果证实P64K蛋白为胞内可溶性表达,表达量约占胞内总蛋白的30％。重组P64K蛋白经Butyl疏水柱、G200分子筛柱和Q阴离子柱三步层析后纯度达到95％以上,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。     

GST-Exendin-4在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

为了制备GST-Exendin-4融合蛋白,以本实验室构建好的pET22b-Exendin-4为模板,通过PCR扩增出Exendin-4基因,酶切克隆入pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Exendin-4.经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同浓度的IPTG和不同温度诱导下,经SDS-PAGE分析鉴定,表达出Mr约为30 kD的目的蛋白,灰度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的29.9%,超声裂解后的上清通过Sepharose 4B亲和层析纯化、透析、除盐及冷冻干燥得到高纯度的目的蛋白.本研究成功制备了高纯度的GST-Exendin-4融合蛋白,为下一步进行目的蛋白大规模的生产打下了良好的基础.     

cre基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白活性的检测

Cre重组酶来自噬菌体P1,可以识别特异的loxP位点的DNA序列,并进行专一性的剪切和拼接,利用PCR技术将cre基因克隆至原核表达载体pET-29a,在大肠杆菌BL21（DE3）得到了高效表达,采用DEAE－52柱层析的方法对表达蛋白进行了纯化,体外生物学活性检测表明,表达蛋白对含有同向loxP位点的质粒有切割活性。     

GST-Smad4融合蛋白的表达与纯化

旨在原核表达Smad4基因,纯化获得GST-Smad4融合蛋白。以人表皮HaCaT细胞的cDNA为模板,利用PCR扩增含有BamH I和SalI酶切位点的Smad4基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-Smad4融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。结果显示,成功构建pGEX-4T-1-Smad4原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Smad4蛋白;经MagneGST particles纯化的GST-Smad4蛋白可被Smad4的抗体特异识别。纯化的GST-Smad4蛋白可用于后续的生物学研究。     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白(p24)在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

在大肠杆菌中,利用新构建的含T7g-10L RBS以及λ-PR启动子的新型原核表达载体,通过表达gag-pol基因片段,获得了具有天然序列的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的高效表达。克隆的gag-pol基因片段在其阅读框架移位区域插入了4bp碱基,其表达的病毒蛋白酶在阅读框架上与gag一致,从而实现了对gag-pol融合蛋白的有效加工,产生成熟的核心蛋白p24及其它产物。重组p24以可溶形式存在,可以被抗p24的单克隆抗体特异识别。测定的N端8个氨基酸序列与从病毒纯化的p24完全一致。在使用硫酸铵沉淀后,采用两步离子柱层析,可将重组蛋白纯化到95％以上的纯度。结果表明,纯化的p24可以作为特异性很强的试剂而用于HIV感染的诊断及病情的预后,并可用于p24的生化及结构分析。     

嗜热木糖异构酶在大肠杆菌中的表达、纯化及性质研究

为获得具有高热稳定性的木糖异构酶,运用基因工程技术,从嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB8中克隆到嗜热木糖异构酶基因xylA。测序结果表明,该基因与GenBank数据库中相比271位的碱基A突变为G,导致氨基酸序列中N91D突变。将该基因克隆到载体pET22b(+),并在E. coli BL21(DE3)中进行高效表达。通过热变性和强阴离子交换两步对该酶进行纯化,并对酶学性质进行了研究。结果表明,该酶最适温度为80 °C,最适pH为8.0,80 °C下半衰期为225 min。在60 °C,pH 7.5该酶的Km为15.20 mmol·L-1,Vmax为69.54 μmol·min-1,kcat为50.62 s-1,kcat/Km为3.33 L·s-1·mmol -1。研究结果为嗜热木糖异构酶的进一步工业应用奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型Gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

利用新型原核表达载体pDOG,在大肠杆菌中高效表达了人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gag基因片段。表达载体利用λPR启动子以及T7g-10的RBS来有效起始表达基因的翻译。表达片段PG1包括p17C-端13个氨基酸、整个p24以及p15N-端74个氨基酸。与PG1相比,PG2片段不含有p17序列,并缺失了p24N-端77个氨基酸。两者的表达量均占总菌体蛋白的20％以上。重组蛋白以包涵体形式存在,在提取包涵体后,经过一步离子柱层析,可以纯化到90％以上的纯度。PG1可被一株抗p24的单抗特异识别,而PG2则不能。纯化的重组蛋白能与HIV-1阳性血清发生很强的特异反应,可以用于HIV-1抗体检测中。     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

人热休克蛋白gp96基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与纯化

热休克蛋白gp96是热休克蛋白90家族成员,能够引起非特异性和特异性免疫反应。得到大量高纯度的蛋白质是研究开发gp96的关键。然而重组的gp96容易在E．coli中降解,并在一定条件下形成多聚体。实验先将人gp96基因克隆到pET-30a载体上并在E．coli Blstar中表达,再经过亲和层析、阴离子交换、分子筛分别纯化gp96。最终去掉了大部分的降解片段和多聚体,得到一定量的可溶性gp96,为进一步研究其结构和功能打下一定的基础。     

硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5的表达、纯化及酶学性质研究

经过PCR克隆得到硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5(3-OST-5)的基因,将其与大肠杆菌表达载体pET-15b连接后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,使用镍亲和层析柱纯化得到具有活性的3-OST-5。经测定纯化后的3-OST-5比活达到0.58 U/mg,是纯化前的5.27倍,回收率达80.4%。在此基础上,研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适温度为35℃,稳定范围为20-40℃;最适pH为7.0,在pH7.0-9.0范围内稳定。在反应液中加入终浓度为1 mmol/L的K+、Ca2+、Ba2+对酶促反应有一定的促进作用。     

HaSNPV几丁质酶重组蛋白的表达、纯化和复性

棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒（HaSNPV）是我国第一个商品病毒杀虫剂,具有使用安全、害虫不产生抗药性等优点,是一种很有发展潜力的生物农药。幼虫虫体受病毒感染后,HaSNPV几丁质酶在其液化过程中起了很大的作用,因此可以作为增效剂以显著提高细菌、病毒、真菌等微生物杀虫剂的毒力,并具有更高的安全性。将HaSNPV几丁质酶基因构建到原核表达载体pET28a中,经测序检验后转化至大肠杆菌Rosetta,然后以IPTG作为诱导剂,目标蛋白以包涵体的形式得以成功表达。在变性条件下,包涵体经镍 次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱层析纯化,并以两种不同的方法进行复性,均可获得具有活性的HaSNPV几丁质酶。     

GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白的表达与鉴定

将合成的人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)突变体基因与IgG4抗体的Fc部分进行融合获得GLP-1-IgG4-Fc片段,获得的基因片段与pXC17.4载体进行连接,用电转化方法将线性化质粒稳定转染CHO-K1细胞,通过Clone Pix 2筛选出高表达细胞株,产量达1.5g/L。收集培养上清并经Protein A和Source 30Q纯化,得到的GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白,SDS-PAGE纯度高于95%,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度和毛细管区域凝胶电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)纯度均不低于80%,尺寸排阻层析(size-exclusion chromatography,SEC)纯度高于99%。经质谱和肽图谱测定,分子量与理论值一致,肽图谱序列与对照品高度一致。生物学活性分析表明,GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白具有促进表达有GLP-1受体的HEK293细胞分泌环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的活性,并且该活性与对照品高度相似。     

Highly efficient expression and purification system of small-size protein domains in Escherichia coli for biochemical characterization

It is often essential to focus the study on the small-size domains of large proteins in eukaryotic cells in the post-genomic era, but the low expression level, insolubility, and instability of the domains have been continuing to hinder the massive purification of domain peptides for structural and biological investigation. In this work, a highly efficient expression and purification system based on a small-size fusion partner GB1 and histidine tag was utilized to solve these problems. Two vectors, namely pGBTNH and pGBH, were constructed to improve expression and facilitate purification. The linker and thrombin cleavage site have been optimized for minimal degradation during purification process. This system has been tested for eight domain peptides varying in size, linker, hydrophobicity, and predicted secondary structure. The results indicate that this system is achievable to produce these domain peptides with high solubility and stability for further biochemical characterization. Moreover, the fusion protein without the linker and thrombin cleavage site is also suitable for spectroscopic studies especially for NMR structural elucidation, if the target peptide is prone to precipitation or easily degraded during purification. This system will be beneficial to the research field of structure and function of small domain and peptide fragment.     

重组人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

目的:利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd)基因的高效原核表达体系,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化、鉴定及活性检测.方法:从正常人脂肪组织里面提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生,采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化,得到高纯度的人源性gAd.运用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行鉴定,通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性.结果:成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的表达,并对形成的包涵体变性、复性和纯化,纯化出的蛋白经过SDS-PAGE和Western分析证实为gAd;通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性.结论:成功构建、表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构(gAd),为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础.