灵活操控果蝇翅芽中wingless基因表达水平的策略

【目的】灵活操控靶基因的表达水平对于研究基因的功能十分重要。Gal4/UAS系统已被广泛应用于调控基因表达,可研究果蝇Drosophila等模式生物复杂的生物学问题。受采用载体的特性及插入位点的影响,Gal4或UAS转基因品系在构建好之后,其调控靶基因的能力基本是确定的。本研究旨在在现有Gal4/UAS系统的基础上,开发一种新的策略,实现在果蝇翅芽中灵活操控wingless(wg)基因的表达水平。【方法】用遗传学手段将黑腹果蝇Drosophila melanogaster品系的UAS-wg和UAS-wg-RNAi转基因重组到同一黑腹果蝇品系中。将该重组黑腹果蝇品系与dpp-Gal4黑腹果蝇品系杂交,同时驱动UAS-wg和UAS-wg-RNAi在果蝇幼虫翅芽中共表达。杂交子代幼虫分别放置在不同的温度(18, 25和30℃)下培养。将幼虫翅芽解剖并进行免疫组化染色,测量染色的荧光强度,分析翅芽中wg的表达水平。【结果】在低温(18℃)下,UAS-wg在基因表达调控中起主要作用,wg表现为超表达,但其超表达的效率可被UAS-wg-RNAi有效地削弱。相反,在高温(30℃)下,UAS-wg-RNAi起主导作用,wg的表达受到抑制。并且通过转换温度,可实现wg在翅芽发育的不同阶段在超表达和抑制之间相互转化,从而灵活地操控wg基因在翅芽中的表达水平。【结论】该方法可以灵活操控果蝇翅芽中wg基因的表达水平,对于调控转基因的表达有重要的意义。     

利用G-TRACE技术追踪果蝇后肠肠细胞谱系的发育模式

【目的】果蝇是完全变态昆虫,蛹期经历了幼虫组织解离和成虫组织重塑的过程。本研究旨在利用细胞谱系追踪方法 G-TRACE(Gal4 technique for real-time and clonal expression)这一新的遗传学技术,检测果蝇幼虫后肠肠细胞在蛹期发育过程中是否发生细胞迁移。【方法】采用黑腹果蝇Drosophila melanogaster engrailed-Gal4(en-Gal4)品系和G-TRACE品系杂交,并引入tub-gal80ts控制Gal4的开启时间,分别在果蝇幼虫期和蛹期进行细胞谱系追踪。幼虫期追踪:亲代产卵后将卵置于30℃培养,3龄中期转入18℃培养,成虫羽化1 d内进行检测。蛹期追踪:亲代产卵后将卵置于18℃培养,在蛹期不同发育阶段转入30℃培养,待虫体羽化后检测成虫肠道。【结果】当在果蝇幼虫期启动细胞谱系追踪,在蛹期停止追踪,发现中肠靠近中后肠边界处以及马氏管存在绿色肠细胞。而当在果蝇幼虫期关闭细胞谱系追踪,在蛹期开始追踪,则发现虫体中肠各部位及马氏管分布着绿色肠细胞。en基因在果蝇蛹期肠道中表达。【结论】结果表明,在果蝇蛹形成过程中,后肠的部分肠细胞迁移至中肠和马氏管,参与中肠和马氏管的重塑。本研究对于探索昆虫在变态发育过程中成虫器官的重塑机制具有重要的意义。     

异位表达Dichaete对果蝇足部发育的影响及其作用机制

【目的】果蝇Dichaete基因是Sox家族B亚家族基因,其表达贯穿整个胚胎发育阶段,在个体发育过程中发挥重要作用。Dichaete在野生型果蝇幼虫足芽上也有微弱表达,然而其在足发育过程中的作用少有报道。本研究旨在研究异位表达Dichaete对果蝇足部形态构成的影响,探索相关的作用机制。【方法】黑腹果蝇Drosophila melanogaster en-Gal4品系雄性成虫与UAS-Dichaete转基因品系处女蝇杂交,驱动Dichaete异位表达,解剖子一代成虫足,在显微镜下观察异位表达的Dichaete对成虫足形态结构的影响;同时采用免疫组化技术检测异位表达Dichaete对果蝇足芽细胞凋亡和Distal-less(Dll)表达的影响。【结果】异位表达Dichaete导致黑腹果蝇成虫足末端结构缺陷,引起3龄幼虫足芽细胞凋亡增加,上调了Distal-less基因的表达,但对Wg和Dpp信号均无影响;抑制细胞凋亡也无法拯救该缺陷。【结论】异位表达Dichaete导致黑腹果蝇成虫足末端结构缺陷,Dichaete可能通过上调Distal-less基因影响足部发育。     

Gal80~(ts)与Gal4组合灵敏控制果蝇中UAS转基因的表达水平

【目的】Gal80~(ts)与Gal4组合驱动UAS转基因表达是黑腹果蝇Drosophila melanogaster研究中常用的转基因过表达遗传学工具,通过温度控制实现对UAS转基因表达的灵活开关。Gal80~(ts)是一种温度敏感型蛋白,低温下(18℃)与Gal4蛋白结合并抑制其转录活力,高温下(29℃)解除对Gal4的抑制,从而允许Gal4结合UAS位点,启动UAS转基因的表达。但是从18~29℃的开关只能强烈过表达UAS转基因,而不能灵活调控转基因的表达水平。本实验系统研究一系列温度下转基因的表达水平,从而实现该体系对转基因的表达水平的灵活控制。【方法】以果蝇翅芽这一常用器官组织为研究模型,以2种Gal4品系(dpp-Gal4和en-Gal4,分别由decapentaplgic和engrailed基因的启动子驱动)分别与tub-Gal80~(ts)(微管蛋白基因tubulin启动子驱动)基因重组后,再分别与UAS-wg(wingless)转基因品系杂交;在一系列温度(18,25,27.5,28,28.5和30℃)下进行子代幼虫培养,通过免疫组化染色揭示并量化分析转基因wg在3龄幼虫翅芽上的表达水平。【结果】18~25℃培养条件下,Gal80~(ts)与Gal4组合系统中的UAS转基因不能表达;30℃时培养,转基因强烈地过表达;在25~30℃区间内,随着温度升高,转基因表达水平逐渐上升。【结论】在25~30℃之间的温度调控可以实现对Gal80~(ts)与Gal4组合系统中的UAS转基因表达水平的调控。本研究结果对调控转基因表达程度有重要价值。     

沙丁胺醇对黑腹果蝇基因组稳定性、细胞凋亡和蛋白表达的影响

【目的】已有研究表明,食用了饲喂以沙丁胺醇为主要成分的瘦肉精的动物肉类后,瘦肉精成分会在人体内富集,摄入过量沙丁胺醇会对生物体造成不良影响,但是,其具体毒性作用机理目前尚不明确。作为一种模式生物,黑腹果蝇Drosophila melanogaster与哺乳动物的基因具有较高的同源性,且具有繁殖周期短、方便进行遗传操作等优势。因此,我们通过研究过量沙丁胺醇对黑腹果蝇基因组稳定性、细胞凋亡和蛋白表达的影响,来探究它对生物体毒性作用的机理。【方法】将野生型黑腹果蝇3龄幼虫用含沙丁胺醇（120 μg/mL）的饲料饲喂2 h后,对幼虫翅成虫盘进行H2Av抗体免疫染色。选取rpr-lacZ转基因黑腹果蝇1龄幼虫用含沙丁胺醇（40 和120 μg/mL）的饲料饲喂,对幼虫翅成虫盘进行lacZ活性测定。提取沙丁胺醇处理后的野生型3龄幼虫总蛋白,采用SDS-PAGE比较对照组和实验组蛋白表达的差异,并通过质谱分析差异蛋白的氨基酸序列。【结果】沙丁胺醇处理后,经免疫荧光染色发现野生型黑腹果蝇幼虫翅成虫盘部分细胞中组蛋白H2Av的量有显著增加。随着沙丁胺醇浓度的增加,转rpr-lacZ报告基因黑腹果蝇成虫盘细胞lacZ活性增强。采用SDS-PAGE和质谱分析表明,沙丁胺醇处理后黑腹果蝇肌动蛋白（Actin-87E）和异柠檬酸脱氢酶表达量上升。【结论】沙丁胺醇处理会引起黑腹果蝇细胞核DNA损伤,对基因稳定性有显著影响,并且会促进细胞凋亡和蛋白表达的改变。沙丁胺醇可能通过促进肌肉收缩和加速生物体能量代谢这两方面来减少脂肪积蓄。     

器官成形素调控果蝇翅芽细胞形貌的研究进展

果蝇翅芽是研究细胞形貌发生的模式系统。在果蝇翅芽的发育过程中,器官成形素由浓度高的区域(成形素表达细胞)向浓度低的区域(接收细胞)移动,形成动态的浓度梯度。器官成形素信号通路的激活调控翅芽细胞的形貌发生、存活、生长和分化。目前已鉴定的在翅芽细胞表达的器官成形素包括Hedgehog(Hh),Decapentaplegic(Dpp)和Wingless(Wg)。结合国际最新研究进展,本文综述了3种器官成形素在翅芽细胞形貌发生过程中的重要作用,讨论了细胞形貌发生的分子机制。     

大双角蝎蛉幼虫复眼超微结构及其在全变态类幼虫侧单眼演化中的意义

【目的】长翅目(Mecoptera)是全变态类昆虫中唯一在幼虫期具有复眼而无侧单眼的类群,是研究昆虫复眼与侧单眼之间演化关系的理想材料。本研究旨在阐明长翅目幼虫复眼的结构特征,为探讨长翅目幼虫复眼与其他全变态类幼虫侧单眼之间的进化关系提供依据。【方法】本研究运用光学显微镜、扫描和透射电子显微镜技术观察了蝎蛉科(Panorpidae)大双角蝎蛉Dicerapanorpa magna(Chou)幼虫复眼的超微结构,并依据其结构特征对长翅目幼虫复眼在全变态类幼虫侧单眼演化中的意义进行了探讨。【结果】结果表明,大双角蝎蛉幼虫复眼属于并列像眼,由50多个小眼组成。小眼由1个角膜、1个晶体、8个视网膜细胞、2个初级色素细胞和数个次级色素细胞等组成。视网膜细胞分为4个远端细胞和4个近端细胞。远端视网膜细胞的视小杆向上延伸包裹着晶体的基部,使视杆末端呈漏斗状。【结论】分层的视网膜细胞和漏斗状的视杆很可能是长翅目幼虫复眼的共有祖征。这两个特征不存在于长翅目成虫复眼中,但存在于许多渐变态类昆虫中。由此推测,长翅目幼虫复眼可能与渐变态类昆虫的复眼存在同源关系。我们认为,长翅目幼虫独有的复眼很可能是全变态类昆虫的祖征,其他全变态类幼虫的侧单眼可能是由复眼演化来的。     

家蚕翅原基细胞的凋亡和自噬分析

【目的】家蚕Bombyx mori翅原基在生长分化过程中伴随着造血器官和翅囊等组织的消失。本研究旨在分析家蚕翅原基生长分化过程中是否存在细胞凋亡和细胞自噬。【方法】制作蛹期0 d翅原基石蜡切片,利用TUNEL法检测细胞凋亡情况;提取5龄第3天、5龄第6天、上簇第1天、预蛹期、蛹期0 d及蛹期第3天的翅原基总RNA,反转录成c DNA,利用定量PCR检测凋亡和自噬相关基因的表达水平;检测了细胞凋亡相关的Caspase 3和细胞自噬相关的酸性磷酸酶活性。【结果】TUNEL染色发现蛹期0 d的翅原基出现部分细胞凋亡现象;细胞凋亡相关基因Caspase 3和Nc主要在5龄幼虫期有高水平表达,细胞凋亡抑制因子IAP主要在幼虫末期有较高水平的表达;Caspase 3酶活性在上簇第1天出现峰值;细胞自噬相关基因Atg5,Atg6,Atg8和Atg12主要在幼虫末期有较高水平的表达;酸性磷酸酶活性也主要在幼虫末期较高。【结论】在幼虫期可能存在细胞凋亡,抑制了翅原基细胞的增殖,进而阻止了翅原基的生长分化;在幼虫末期可能同时存在细胞凋亡和自噬,促进翅囊等的退化,同时阻止了翅原基细胞的增殖,推动了翅原基向蛹翅的发育。     

Bmttv在家蚕翅发育过程中的功能分析

【目的】探析家蚕Bombyx mori糖基转移酶基因Bmttv在家蚕翅发育过程中的功能。【方法】通过RACE克隆家蚕Bmttv的CDS全长序列并进行生物信息学分析；使用qRT-PCR检测Bmttv在家蚕不同发育阶段(5龄幼虫、游走期幼虫、预蛹、蛹和成虫)和5龄幼虫不同组织(表皮、翅原基、精巢、马氏管、气管、丝腺、头、血淋巴、脂肪体和中肠)中的表达量；构建过表达载体，瞬时转染BmE细胞，通过免疫荧光对BmTTV进行亚细胞定位，利用qRT-PCR检测家蚕翅发育关键基因BmHippo,Bmwg,BmDpp,Bmsotv和BmHh的表达量。【结果】成功克隆到家蚕Bmttv的CDS全长序列，长2 228 bp; BmTTV蛋白具有两个特殊结构域，均与硫酸肝素聚糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPGs)的合成相关，与黑腹果蝇Drosophila melanogaster和智人Homo sapiens TTV的氨基酸序列一致性达45%左右，与鳞翅目昆虫TTV的亲缘关系更近。Bmttv主要在家蚕蛹期开始高量表达，在5龄幼虫中肠、精巢和翅原基中高量表达。BmTTV主要...     

布拉迪小环腹瘿蜂的生物学特性及其寄生对黑腹果蝇生长发育的影响

【目的】调查布拉迪小环腹瘿蜂Leptopilina boulardi的生物学特性,明确该寄生蜂寄生对寄主黑腹果蝇Drosophila melanogaster生长发育的影响。【方法】运用形态成像和统计学的方法,对布拉迪小环腹瘿蜂的发育历期和寄生效率等生物学特性进行研究,同时对布拉迪小环腹瘿蜂寄生后寄主黑腹果蝇发育历期以及蛹期体长和体重的变化进行统计分析。【结果】布拉迪小环腹瘿蜂的卵期平均为0. 98±0. 22 d,幼虫期为10. 22±0. 57 d,雄虫蛹期为8. 09±0. 19 d,雌虫蛹期10. 07±0. 30 d,雌蜂平均比雄蜂约晚2 d羽化。布拉迪小环腹瘿蜂寄生黑腹果蝇2龄幼虫后,黑腹果蝇幼虫出现明显的黑化包囊反应,幼虫发育显著延缓,蛹长和蛹重也显著降低。【结论】布拉迪小环腹瘿蜂是黑腹果蝇的专性寄生蜂。本研究的结果为寄生蜂调控寄主的机制提供了实验依据。     

Conserved overlapping and reciprocal expression of msh/Msx1 and apterous/Lhx2 in Drosophila and mice

Here we describe and compare the expression patterns of the murine genes Lhx2 and Msx1 and their Drosophila orthologues apterous (ap) and muscle-segment homeobox (msh). We find that Lhx2 and Msx1 show complementary patterns of expression in most tissues including the neural and cranial epithelium, pituitary gland, olfactory organs, and neural tube; in contrast, Lhx2 and Msx1 are coexpressed in the developing limbs. Strikingly, the spatial relationship between ap and msh expression in Drosophila is very reminiscent of the expression of their murine orthologues. ap and msh show complementary expression in the leg and antennal imaginal discs, brain and ventral ganglion of the central nervous system (CNS), but both are coexpressed in the wing imaginal disc. These observations suggest conservation in the regulation of these genes between Drosophila and mice.     

CELLULAR LOCALIZATION AND EXPRESSION OF pygo DURING DROSOPHILA DEVELOPMENT

Abstract Wg/Wnt signaling is a key signaling pathway in Drosophila. Many genes involved in Wingless(wg) signal transduction pathway downstream of Wg, or it s vertebrate Wg homologue Wnt, have been identified. Transduction of the Wg signal downstream of Wg is mediated by nuclear TCF/LEF-1, through association with Armadillo (Arm)β-catenin. Pygopus (pygo) is a new identified component in this pathway. Cellular localization experiment showed that pygo was expressed specifically in the nucleus. The expression profile of pygo in embryos was examined using in situ hybridization. Although pygo expressed ubiquitously in the embryos, it expressed at relatively high level in pre-blastoderm embryos which indicate a high degree of maternally provided message, followed by a low level of ubiquitous zygotic expression. This continues into larval tissues (including wing disc, eye disc and leg disc), where pygo appears to be expressed at low level. Comparison of pygo expression levels, in the wing disc, eye disc and leg disc, showed pygo expression level in the wing disc pouch and leg disc were relative higher.     

A genomic analysis of Drosophila somatic sexual differentiation and its regulation

In virtually all animals, males and females are morphologically, physiologically and behaviorally distinct. Using cDNA microarrays representing one-third of Drosophila genes to identify genes expressed sex-differentially in somatic tissues, we performed an expression analysis on adult males and females that: (1) were wild type; (2) lacked a germline; or (3) were mutant for sex-determination regulatory genes. Statistical analysis identified 63 genes sex-differentially expressed in the soma, 20 of which have been confirmed by RNA blots thus far. In situ hybridization experiments with 11 of these genes showed they were sex-differentially expressed only in internal genital organs. The nature of the products these genes encode provides insight into the molecular physiology of these reproductive tissues. Analysis of the regulation of these genes revealed that their adult expression patterns are specified by the sex hierarchy during development, and that doublesex probably functions in diverse ways to set their activities.     

Dissection of the target specificity of the RNA-binding protein HOW reveals dpp mRNA as a novel HOW target

Regulation of RNA metabolism plays a major role in controlling gene expression during developmental processes. The Drosophila RNA-binding protein Held out wing (HOW), regulates an array of developmental processes in embryonic and adult growth. We have characterized the primary sequence and secondary structural requirements for the HOW response element (HRE), and show that this site is necessary and sufficient for HOW binding. Based on this analysis, we have identified the Drosophila TGFbeta homolog, dpp, as a novel direct target for HOW negative regulation in the wing imaginal disc. The binding of the repressor isoform HOW(L) to the dpp 3' untranslated region (UTR) leads to a reduction of GFP-dpp3'UTR reporter levels in S-2 cells, in an HRE site-dependent manner. Moreover, co-expression of HOW(L) in the wing imaginal disc with a dpp-GFP fusion construct led to a reduction in DPP-GFP levels in a dpp-3'UTR-dependent manner. Conversely, a reduction of the endogenous levels of HOW by targeted expression of HOW-specific double-stranded RNA led to a corresponding elevation in dpp mRNA level in the wing imaginal disc. Thus, by characterizing the RNA sequences that bind HOW, we demonstrate a novel aspect of regulation, at the mRNA level, of Drosophila DPP.