生物可降解微球作为HPV-E7 蛋白免疫佐剂的研究

目的:对聚乳酸聚羟基乙酸(PGLA)作为疫苗运输载体进行免疫学评价。方法:用复乳法制备PLGA微球,通过表面吸附人乳头状瘤病毒(HPV)E7蛋白制备成聚乳酸聚羟基乙酸(PGLA)微球,考察粒径分布情况及体外释放水平,通过皮下免疫注射途径免疫C57BL/6小鼠,用间接ELISA法检测免疫鼠血清中的抗体水平,由此评价PLGA微球疫苗运输载体的佐剂效应。。结果:复乳法制备的PLGA微球表面光滑,大小均匀,包封率20.1%,注射小鼠6周后(第2周加强免疫1次),微球疫苗诱导产生的IgG1抗体水平较同剂量的铝佐剂组和溴化二甲基双十八胺(DDA)组明显升高,(平均滴度分别为3805、1270、2262);微球疫苗诱导产生IgG2b的抗体水平明显高于铝佐剂组,略低于DDA组,(平均滴度分别为1131、475、2653)而IgG2c的抗体量高于铝佐剂组和DDA组(平均滴度分别为150、36、106)。结论:人乳头状瘤病毒E7蛋白聚乳酸羟基乙酸微球作为疫苗输送体系可以明显的提高抗原的免疫原性。     

戊型肝炎病毒重组颗粒性蛋白疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答研究

HEV 239是福建省医学分子病毒学研究中心实验室研制的一种戊型肝炎病毒（HEV）重组颗粒性蛋白疫苗,该文旨在研究HEV239蛋白疫苗在小鼠体内诱导产生特异性免疫应答的情况.将5μg HEV 239蛋白疫苗（239-Pro）、加铝佐剂疫苗（239-Vac）或加弗氏佐剂疫苗（239-CFA）肌肉注射免疫BALB/c鼠3次,第8周检测鼠血清抗HEV抗体及其亚类,同时用ELISPOT方法检测细胞毒性T细胞（CTL）应答.结果显示：239-Vac诱导的抗体滴度与239-CFA相当,高于无佐剂的239-Pro.239-Vac诱导的抗体中,IgG1/IgG2a比值显著高于239-CFA和239-Pro,主要为Th2型应答.除239-CFA之外,239-Vac和239-Pro也可诱导出一定的HEV抗原特异性I型Tc应答.提示：重组抗原HEV 239能诱导良好的抗体应答及一定的Tc1应答.     

生物可降解微球作为HPV-E7蛋白免疫佐剂的研究

目的：对聚乳酸聚羟基乙酸（PGLA）作为疫苗运输载体进行免疫学评价。方法：用复乳法制备PLGA微球,通过表面吸附人乳头状瘤病毒（HPV）E7蛋白制备成聚乳酸聚羟基乙酸（PGLA）微球,考察粒径分布情况及体外释放水平,通过皮下免疫注射途径免疫C57BL/6小鼠,用间接ELISA法检测免疫鼠血清中的抗体水平,由此评价PLGA微球疫苗运输载体的佐剂效应。。结果：复乳法制备的PLGA微球表面光滑,大小均匀,包封率20.1%,注射小鼠6周后（第2周加强免疫1次）,微球疫苗诱导产生的IgG1抗体水平较同剂量的铝佐剂组和溴化二甲基双十八胺（DDA）组明显升高,（平均滴度分别为3805、1270、2262）;微球疫苗诱导产生IgG2b的抗体水平明显高于铝佐剂组,略低于DDA组,（平均滴度分别为1131、475、2653）而IgG2c的抗体量高于铝佐剂组和DDA组（平均滴度分别为150、36、106）。结论：人乳头状瘤病毒E7蛋白聚乳酸羟基乙酸微球作为疫苗输送体系可以明显的提高抗原的免疫原性。     

HEVAg-PLGA纳米颗粒疫苗小鼠体内免疫学研究

研究重组戊型肝炎抗原(HEVAg)-乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)纳米颗粒抗原能否在动物体内诱导产生免疫应答。制备HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原后,通过皮下、滴鼻、口服途径接种Balb/c小鼠,每隔4周加强免疫两次,HEVAg与铝盐佐剂(铝佐剂疫苗Al_2O_3-Ag)为对照组,一定时间内检测抗体及细胞因子的应答水平。结果HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原在小鼠体内诱导产生有效的体液免疫、细胞免疫。滴鼻、口服途径黏膜系统中诱导产生较高滴度的IgA抗体,ELISPOT结果显示鼻腔、唾液腺中IgA ASCs数量显著增加;皮下途径诱导产生较高滴度的IgG抗体;常规铝佐剂疫苗相比于HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原诱导较强的IgG抗体水平,未诱导产生黏膜免疫应答;HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原诱导产生较强细胞免疫应答,皮下接种途径IFN-γ、IL-4生成细胞数量显著高于其它免疫组。与铝佐剂疫苗相比,HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原能有效诱导产生系统免疫及黏膜免疫应答,显示HEVAg-PLGA有潜力成为备选HEV黏膜疫苗抗原,同时展示PLGA颗粒作为黏膜系统抗原递送载体及黏膜佐剂的优越性。     

粘膜免疫戊型肝炎试验性疫苗的研究

采用原核表达的戊型肝炎病毒结构区基因(HEV ORF2)编码蛋白,与新型人用疫苗佐剂类MF59配制成试验性疫苗,通过粘膜免疫途径免疫实验小鼠,研究其产生粘膜免疫和体液免疫的效果。结果表明,通过滴鼻和灌胃两种粘膜免疫途径免疫BALB／c小鼠,均能诱导小鼠产生针对HEV ORF2试验性疫苗的血清IgG和IgA,血清IgG的抗体滴度为1：800～1：1600,血清IgA抗体滴度为1：100～1：200。对免疫小鼠血清中IgG的动态观察表明,血清抗体可持续存在至少6个月以上。比较类MF159佐剂和传统铝盐佐剂经注射免疫所诱导产生的血清IgG抗体滴度,发现类MF59佐剂可有效增强HEV0RF2重组蛋白的免疫原性4倍左右。类MF159佐剂可诱导粘膜免疫反应,在肠道粘膜部位产生SIgA,滴度为1：100。这些结果为新型戊型肝炎病毒基因工程重组疫苗的研制提供了一条新的思路。     

不同佐剂对含S+PreS1融合抗原的乙型肝炎病毒颗粒疫苗免疫原性的影响

本研究在前期工作基础上,用CHO细胞表达的含PreS1+S融合抗原的新型基因工程HBV颗粒疫苗(HBSS1)与Al(OH)3、CpG及CpG+Al(OH)3等佐剂配伍,在Balb/C小鼠模型上研究不同佐剂对HBV颗粒疫苗肌肉注射后免疫应答的影响,主要包括抗体滴度、抗体亚型分类及特异性细胞免疫(γ-IFNELISpot检测)。结果表明:CpG佐剂结合HBSS1颗粒疫苗可快速诱导(单针免疫)高水平的抗PreS1及S抗体,IgG2a/IgG1比率1,同时可诱导较高抗原特异的细胞免疫应答;Al(OH)3+CpG双佐剂组一次免疫后可诱导产生最高的抗S抗体滴度(1:105),其产生的抗体亚类包括IgG1、IgG2a与IgG2b;在S抗原N端(13~49aa)存在优势CTL表位。结论:CpG佐剂结合HBSS1颗粒疫苗应是发展新型治疗性乙肝疫苗的较佳选项。     

基于rV270抗原的鼠疫多孔微球疫苗的制备及其免疫保护作用评价

目的：评价生物可降解高分子材料多孔微球作为鼠疫亚单位疫苗佐剂的可行性。方法：制备可生物降解的高分子材料多孔微球,将rV270抗原蛋白吸附到多孔微球中制备微球疫苗,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,初次免疫后21d加强免疫1次,于初次免疫后第10周用600LD50鼠疫耶尔森氏菌攻毒,攻毒后观察14d。结果：攻毒后,微球疫苗免疫的小鼠全部存活,且健康状况良好,对照组小鼠几乎全部死亡。结论：生物可降解多孔微球可作为免疫佐剂用于鼠疫亚单位疫苗研制。     

玉竹多糖对流感病毒裂解疫苗的黏膜佐剂效应

探讨玉竹多糖(Polygonatum odoratun polysaccharides,POP)对流感病毒裂解疫苗黏膜免疫的佐剂效果。以BALB/c小鼠为模型,将H7N9流感病毒裂解疫苗单独或者添加不同剂量的POP(400、600、800、1 000和1200μg)做佐剂一次性滴鼻免疫小鼠,免疫三周后小鼠以致死剂量同源病毒攻击。实验结果表明,当在疫苗中加入1 000μg POP时,与疫苗单独免疫相比,单次滴鼻免疫就明显增强了小鼠抵抗致死量病毒感染的能力,体重丢失减少,肺部残余病毒滴度下降,存活率提高;血清中疫苗特异性IgG抗体和HI抗体以及鼻洗液中SIgA抗体都提高了;IgG亚类抗体检测显示,POP的加入显著增加了IgG1的抗体滴度,但抑制了IgG2a的产生,说明诱导的免疫应答偏向于Th2型。实验表明POP在一定剂量时能增强疫苗诱导的免疫应答,显示出黏膜佐剂效应。     

阳离子脂质体DOTAP佐剂对H5N1流感病毒裂解疫苗免疫效果的影响

目的研究阳离子脂质体DOTAP佐剂对H5N1型流感病毒裂解疫苗免疫效果的影响。方法制备DOTAP阳离子脂质体流感病毒裂解疫苗(简称DOTAP流感裂解疫苗),检测其包封率。将BALB/c小鼠分为13组,分别用含0.1、1.0、10.0μg HA/只剂量以DOTAP、Al(OH)3、CPG-ODN为佐剂以及不含佐剂的流感裂解疫苗于0、21天皮下免疫,PBS作为对照组,用血凝抑制试验检测小鼠初次免疫后21、42天血清HI抗体滴度;用ELISA检测初次免疫后21、42天血清特异性IgG抗体、IgG1、IgG2a亚类抗体滴度,以及初次免疫后42天小鼠脾脏单个核细胞体外经抗原刺激后细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的分泌水平。将BALB/c小鼠分为3组,分别用含不同DOTAP剂量(100、300、600μg/只)的DOTAP流感裂解疫苗于0、21天皮下免疫,检测初次免疫后21、42天小鼠血清HI抗体滴度和IgG抗体滴度。结果 DOTAP流感裂解疫苗粒径在300~400 nm,带正电荷,包封率在50%以上;DOTAP流感裂解疫苗诱导的HI抗体水平和特异性IgG抗体水平均高于流感裂解疫苗,而与铝佐剂和Cp G-ODN佐剂间差异无统计学意义;DOTAP流感裂解疫苗产生的抗体仍以IgG1亚类抗体为主,免疫后42天诱导的IgG2a亚类抗体水平高于流感裂解疫苗和铝佐剂,低于Cp G-ODN佐剂;DOTAP流感裂解疫苗免疫后既分泌高水平Th1型细胞因子IFN-γ,同时也分泌高水平Th2型细胞因子IL-4;不同DOTAP剂量的DOTAP流感裂解疫苗免疫后,其HI抗体滴度和IgG抗体滴度在低、中、高剂量组之间存在明显的量效关系。结论 DOTAP作为H5N1型流感病毒裂解疫苗的佐剂可显著提高流感裂解疫苗的免疫原性,其对体液免疫应答的增强作用不低于铝佐剂和Cp G-ODN佐剂,并具有诱导细胞免疫应答的能力。     

不同佐剂肾综合征出血热纯化疫苗体液免疫效果的研究

在肾综合征出血热(HFRS)纯化疫苗原液中分别加入Al(OH)3、IL-2、GM-CSF、CFA等佐剂的一种或两种,以不加佐剂的纯化疫苗原液作为对照,分别免疫BALB/c小鼠,定期进行眼眶采血,用ELISA法检测血清中抗HFRS病毒的抗体水平。用不同佐剂的HFRS纯化疫苗免疫BALB/c小鼠后,其抗体产生的时间和滴度均不同。佐剂组与对照组相比抗体产生早且(或)滴度高,IL-2佐剂组在免后第3天就可以检测到抗体;联合使用两种佐剂组与单独使用一种佐剂组相比,抗体产生早、滴度高。结果表明,上述各种佐剂对HFRS纯化疫苗诱导BALB/c小鼠产生的免疫应答均有一定的增强作用;IL-2对早期免疫应答、早期抗体的产生有显著意义;联合应用两种佐剂疫苗的免疫效果优于只加其中一种佐剂的疫苗。     

大肠杆菌重组颗粒性戊型肝炎疫苗对恒河猴的免疫保护

大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白ORF2片段HEV 239重组蛋白颗粒,经铝佐剂吸附后,分别以5μg、10μg和20μg剂量免疫恒河猴,28天时以相同剂量加强免疫1次,3周后分别以不同病毒滴度的基因Ⅰ型或基因Ⅳ型HEV静脉攻击.结果,加强后3周,3个免疫剂量组猴的抗体几何平均滴度分别为1∶27175、1∶34409、1∶41607,以世界卫生组织参比血清定量,则分别为1098IU/ml,1357IU/ml、1724IU/ml.每个剂量免疫组及对照组各有3只猴接受107病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染,对照组3只猴均被成功感染,2只出现肝炎;20μg免疫组3只猴均未被感染;10μg和5μg免疫组各有2只猴未被感染,另1只猴出现短暂感染,免疫猴均未出现肝炎.3个剂量免疫组及对照组另外3只猴,接受104病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染,对照组3只猴均被感染,1只出现肝炎;而免疫猴均未被感染,也未出现肝炎.3只10μg免疫猴和3只对照猴分别接受107病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染,对照组均被感染并出现肝炎,而免疫组均未出现肝炎,有2只未被感染,另1只被短暂感染.另有3只10μg免疫猴和3只对照猴分别接受104病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染,对照组均被感染,而免疫组均未被感染.这些结果表明:HEV239疫苗可以完全预防HEV导致的肝炎,并保护大多数恒河猴不被HEV感染.另外,疫苗对基因Ⅳ型HEV的保护性与基因Ⅰ型HEV相近.     

Structural and Functional Characterization of Liposomal Recombinant Hepatitis B Vaccine

Abstract

Liposomal hepatitis B vaccine was prepared by encapsulating recombinant 22-nm hepatitis B surface antigen (HBsAg) particles derived from a Chinese hamster ovary (CHO) cell line in multilammelar lipid vesicles (MLV) composed of 9:1 dimyristoyl phosphatidyl-choline/dimyristoyl phosphatidylglycerol. The CHO-derived HBsAg particles reveal 6 bands in polyacrylamide gel electrophoresis related to the presence of 3 peptides (S, M, & L). Four different methods were used to prepare the MLV vaccine, each resulting in freeze-dried powder which upon hydration gave MLV of a similar mean size, 4.5 μm. The humoral response to these 4 liposomal vaccines in mice was dependent on the method of preparation, but for all of them it was better than the response to alum-based vaccine (especially at a low dose of antigen). Comparison of vaccination using “naked” HBsAg particles, particles adsorbed to alum, and particles encapsulated in liposomes demonstrated that at low dose of antigen the liposomal vaccine was superior in eliciting humoral response. Encapsulation in liposomes did not improve specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) response. The alum in the vaccine completely eliminates CTL response, though it improved the humoral response by increasing the linear range in the antigen dose-response curve (increasing the antibody titer at high antigen dose). A similar response profile was obtained with recombinant yeast (Hansenula) 22-nm particles composed of a single non-glycosylated (p24) peptide and lipids. The similarity in the response to the mammalian cell and yeast derived vaccine suggests that the physical nature of the vaccine, more than the exact composition, determines the balance between humoral and CTL responses.     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)鉴别试验的方法研究

目的：建立重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)鉴别试验的方法。方法：取重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)以1：10比例加入lmol/L盐酸调节pH值,采用ELISA双抗体夹心法检测,同时设以氢氧化铝、未处理的重组乙型肝炎疫苗、狂犬疫苗、出血热疫苗,以及试剂盒的阴、阳性作为对照。结果：狂犬疫苗、出血热疫苗及氢氧化铝对照为阴性,直接检测重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)呈弱阳性,加入盐酸调节pH值后原倍样品呈弱阳性,10倍稀释后呈强阳性。采用该方法检测5批疫苗均呈强阳性。组内平行试验,组间重复试验。结论：将重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)调节pH值后10倍稀释,用ELISA双抗体夹心法检测呈阳性,而且稳定可靠,该方法可用于该疫苗的鉴别试验。     

CpG对乙型肝炎基因重组(CHO细胞)疫苗免疫效果的影响

为了研究CpG-寡脱氧核苷酸(CpG-OPN)作为佐剂对乙型肝炎基因重组(CHO细胞)疫苗(简称乙肝疫苗)免疫效果的影响,以乙肝疫苗加Al(OH)3、疫苗加CpG和疫苗加Al(OH)3与CpG3三种配伍方式,通过腹腔、皮下或肌内3种不同途径免疫Balb/c小鼠,观察不同免疫途径和不同配伍的免疫效果.同时又将疫苗与CpG混合后在4℃存放6个月再免疫小鼠,观察CpG的稳定性.结果表明:①3种免疫途径中以肌内注射效果最好,这在使用CpG的实验组尤为明显,在该组肌内免疫的ED50比腹腔的低了10倍,而诱发的抗体滴度提高了3倍;②疫苗与CpG、Al(OH)3联合使用的免疫效果最好,在肌内免疫时联合使用的免疫效果比疫苗+Al(OH)3提高4倍,比疫苗+CpG提高7倍;③疫苗+Al(OH)3免疫时,表现为IgG1抗体亚型占优势,而再加入CpG后则IgG1和IgG2a均升高,以IgG2a最显著;④疫苗与CpG混合后4℃保存半年,不影响其活性.     

重组(CHO细胞)乙型肝炎疫苗细菌内毒素含量检测法的建立

采用鲎试剂法检测重组 (CHO细胞 )乙型肝炎疫苗中的细菌内毒素含量 ,研究了甲醛、硫柳汞、氢氧化铝等疫苗成分对鲎试剂试验的影响。结果表明 ,疫苗中各成分对检测未见影响 ,所以检测本疫苗中内毒素含量时 ,采用鲎试剂法是可行的。同时 ,用此试验方法对本室所生产的重组 (CHO细胞 )乙型肝炎疫苗进行了检测 ,疫苗中内毒素含量全部合格     

结核分枝杆菌组合DNA疫苗的免疫效果

以编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、ESAT 6和MPT6 3的基因为插入片段 ,构建核酸疫苗联合免疫小鼠。以原核表达纯化的抗原为检测物 ,检测了抗原特异性的抗体和γ 干扰素的形成。研究表明 ,组合核酸疫苗第 3次免疫后 2 1天 ,实验小鼠血清中Ag85B抗体滴度达到 10 5以上 ,Ag85B抗原刺激产生的特异性γ 干扰素达到 (17.0± 7.0 )u/ml。组合疫苗虽然没有提高小鼠血清中ESAT 6及MPT6 3蛋白的特异性抗体滴度 ,但仍显著刺激产生了两种特异性的 γ 干扰素。攻毒实验表明 ,经组合疫苗免疫后小鼠肺部结核杆菌数量显著下降。肺部切片显示 ,免疫小鼠病理状况较对照组有明显改善。因此 ,研究提示Ag85B等组合核酸疫苗具有较好的结核病预防效果。     

一种新型丙型肝炎病毒培养方法的建立

以丙肝病毒 (ＨＣＶ)为切入点 ,建立一套通过基因操作技术在体外细胞培养系统中生产高滴度反转录病毒颗粒的大规模病毒培养技术平台 ,并将该技术应用于其它难以体外大规模培养的反转录病毒的生产。该体系包括一株插入Ｔ7ＲＮＡ聚合酶基因的重组痘苗病毒ｖＴＦ 3和 2个重组质粒 ,质粒ＰＴ7ＨＣＶ在上游Ｔ7启动子和Ｔ7终止子之间插入ＨＣＶ基因组ｃＤＮＡ ,可通过Ｔ7ＲＮＡ聚合酶指导转录产生 9 5ｋｂ的ＨＣＶＲＮＡ ;另一质粒Ｐ...